Préparation Solution Tris-HCl

[invited71000a5]

Bonjour à tous,

J'ai un protocole à réaliser pour préparer un tampon de lyse, mais je bloque sur un point.

Une des étapes est de préparer une solution Tris-HCl 100mM pH 8,5 :

pour un tampon de lyse de 500mL :
- 50mL de Tris-HCl à 1M : 1576mg de poudre dans 10mL, on ajuste le PH avec de la soude dissoute dans de l'eau, au pH-metre, sous agitation

Mon problème, c'est que je n'ai aucun ordre d'idée de la quantité de soude à mettre. Je comprends juste qu'il faut que je rajoute 40mL de soude dissoute (pour atteindre les 50mL voulu), mais pour atteindre un pH de 8,5, est-ce que vous savez approximativement la quantité de soudre à dissoude, ou bien le pH que doit avoir cette solution de soude.

Pour résoudre ce problème je pourrai très bien y aller pas à pas, mais ça risque de prendre du temps et de gacher des solutions avant de tomber sur le pH voulu. Alors peut-être que y'a une formule ou une méthode plus simple ?


Je vous remercie par avance.
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[jmbowie]

Bonjour à tous,

J'ai un protocole à réaliser pour préparer un tampon de lyse, mais je bloque sur un point.

Une des étapes est de préparer une solution Tris-HCl 100mM pH 8,5 :

pour un tampon de lyse de 500mL :
- 50mL de Tris-HCl à 1M : 1576mg de poudre dans 10mL, on ajuste le PH avec de la soude dissoute dans de l'eau, au pH-metre, sous agitation

Mon problème, c'est que je n'ai aucun ordre d'idée de la quantité de soude à mettre. Je comprends juste qu'il faut que je rajoute 40mL de soude dissoute (pour atteindre les 50mL voulu), mais pour atteindre un pH de 8,5, est-ce que vous savez approximativement la quantité de soudre à dissoude, ou bien le pH que doit avoir cette solution de soude.

Pour résoudre ce problème je pourrai très bien y aller pas à pas, mais ça risque de prendre du temps et de gacher des solutions avant de tomber sur le pH voulu. Alors peut-être que y'a une formule ou une méthode plus simple ?


Je vous remercie par avance.

Utilise de la soude très concentré (5 ou 10N) de sorte que le volume de soude que tu auras à ajouter sera négligeable et ne modifiera pas ta concentration final en Tris-HCl. Le pKA du Tris est de 8,3 donc tu ne devrais pas être loin du pH que tu désires au final. D'autre part, l'important dans ta solution, c'est qu'elle est le bon pH, pas que la concentration en Tris soit exact au dixième de mM près.

[invited71000a5]

Merci pour cette réponse.

Mais dans tous les cas le volume de soude que je dois rajouter est de 40mL (10mL de Tris + 40mL de soude = 50mL).

[MaliciaR]

Merci pour cette réponse.

Mais dans tous les cas le volume de soude que je dois rajouter est de 40mL (10mL de Tris + 40mL de soude = 50mL).

Euh... J'ai un souci avec ton calcul de volume : tu as besoin de 50 ml de Tris-HCl, pas de 10 mL de Tris-HCl dans 50 mL de mélange final de Tris-HCL. Je me trompe?

Donc, dans ce cas, tu fais ton calcul pour 50 mL de Tris-HCl (une règle de 3 bête et méchante) et tu ajustes toute la solution à pH 8,5. J'ai quand même un doute qu'ajouter 40 mL de soude à 10 mL qui sont déjà à pH 8,3 fasse que tu aies 50 mL final de Tris-HCl à pH 8,5...


Cordialement,

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited71000a5]

Dans mon protocole il est écrit :

Préparer un grand volume de tampon de lyse (pour 500mL) :
- 50 mL de Tris-HCl à 1M : 1576mg de poudre dans 10mL, on ajuste le pH avec de le soude dissoute dans de l'eau, au pHmètre, sous agitation
- 930,5mg d'EDTA
- 5mL de SDS
- 8 343mg de NaCl
- 4950mL H2O

Donc effectivement tu as raison je ne dois pas rajouter 40mL de soude ; les quantités qui me sont données sont bien pour 10mL pour avoir une concentration finale de 1M. Donc si j'en veux 50mL je multiplie tout par 5.
Je suis OK !
Donc en fait soit je dois rajouter qu'un tout peit volume de soude, ne changeant pas énormément mon volume finale donc ma concentration. Soit je dissout ma poudre Tris-Hcl dans dans 10mL d'H2O contenant déjà la soude mais la ce n est pas pratique pour connaitre le pH a l avance...

[jmbowie]

Dans mon protocole il est écrit :

Préparer un grand volume de tampon de lyse (pour 500mL) :
- 50 mL de Tris-HCl à 1M : 1576mg de poudre dans 10mL, on ajuste le pH avec de le soude dissoute dans de l'eau, au pHmètre, sous agitation
- 930,5mg d'EDTA
- 5mL de SDS
- 8 343mg de NaCl
- 4950mL H2O

Donc effectivement tu as raison je ne dois pas rajouter 40mL de soude ; les quantités qui me sont données sont bien pour 10mL pour avoir une concentration finale de 1M. Donc si j'en veux 50mL je multiplie tout par 5.
Je suis OK !
Donc en fait soit je dois rajouter qu'un tout peit volume de soude, ne changeant pas énormément mon volume finale donc ma concentration. Soit je dissout ma poudre Tris-Hcl dans dans 10mL d'H2O contenant déjà la soude mais la ce n est pas pratique pour connaitre le pH a l avance...

Non non, dissout déjà ta poudre dans un peu d'eau (20 ml par exemple) et une fois dissoute, ajuste le volume puis le pH. Avec de la soude bien concentré, quelques gouttes suffiront.

[MaliciaR]

Hello,

Donc en fait soit je dois rajouter qu'un tout peit volume de soude, ne changeant pas énormément mon volume finale donc ma concentration. Soit je dissout ma poudre Tris-Hcl dans dans 10mL d'H2O contenant déjà la soude mais la ce n est pas pratique pour connaitre le pH a l avance...

Bon, je vais le dire autrement : est-ce que le fait d'ajouter de la soude changera énormément ta composition du Tris-HCl? C'est quoi le Tris-HCl? La composition du Tris c'est ça : C₄H₁₁NO₃.
Ce machin est basique. C'est une poudre que l'on dissout dans de l'eau. Et il me semble que c'est très basique même, parce que je dois rajouter pas mal de HCl pour arriver à mon pH souhaité (7,7)...
Je ne sais pas qui t'encadre, mais il y a des trucs à ré-expliquer

Il y a deux choses auxquelles il faut faire gaffe :
* ne jamais mettre les doigts dans ta poudre;
* il vaut mieux éviter de s'en servir avec une spatule, même si tu l'as lavée... Tu risques de contaminer toute la boîte...

Tu règles ton pH-mètre, puis tu y vas doucement avec la soude (ou l'acide)en n'oubliant pas de mettre l'agitateur au fond de ton récipient.
Et comme ton Tris risque de prendre en volume, tu ne mets pas l'eau jusqu'à 50 mL. Tu mets 30 mL avec la poudre nécessaire pour 50 mL final, tu ajustes ton pH, et ce n'est que là que tu ajustes avec l'eau jusqu'au volume final souhaité. Sinon, tu vas te retrouver avec un machin inexploitable

Bon courage et n'hésite pas à poser des questions aux gens qui t'encadrent, ils sont là pour ça


Cordialement,

[piwi]

Bon, je vais le dire autrement : est-ce que le fait d'ajouter de la soude changera énormément ta composition du Tris-HCl? C'est quoi le Tris-HCl? La composition du Tris c'est ça : C4H11NO3.
Ce machin est basique. C'est une poudre que l'on dissout dans de l'eau. Et il me semble que c'est très basique même, parce que je dois rajouter pas mal de HCl pour arriver à mon pH souhaité (7,7)...
Je ne sais pas qui t'encadre, mais il y a des trucs à ré-expliquer

Inutile d'être cassant vis à vis des encadrant que nous ne connaissons pas. Merci pour eux.
Ensuite le Tris n'est pas vendu sous la forme Tris. Il en existe deux types:
le Tris HCl
le Tris Base (ammonium)
Donc le Tris n'est pas nécessairement très basique comme tu l'affirmes. Tout dépend de ce avec quoi tu le prépares. En général, pour éviter d'avoir à ajouter une tonne d'acide ou de base il est préférable de faire un mélange des deux Tris pour n'avoir à ajuster le pH qu'a la marge.

Je vous donne la composition du Tris 1M pH 8.5 (25°C) (pour 1L)
Tris HCl: 44.2g
Tris Base: 87.2g
mettez, disons, 800 ml d'eau, ajustez le pH puis competez au volume exact.

Le Tris est une solution de base que l'on ne prépare pas au coup par coup. On en fait 1L et on le garde indéfiniment pour toutes les applications.

Il y a deux choses auxquelles il faut faire gaffe :
* ne jamais mettre les doigts dans ta poudre;
* il vaut mieux éviter de s'en servir avec une spatule, même si tu l'as lavée... Tu risques de contaminer toute la boîte...

Le premier point est une évidence. Non pas pour la propreté de la boite mais votre santé.
J'ai plus de mal à cerner les tenants du second point. Si la spatule est propre je vois mal avec quoi on risque de tellement contaminer une boite. De toute manière, quand on veut peser la poudre il faut bien pouvoir la prendre. Ces poudres sont vendues par 500g ou par kg et ont tendance à s'agglomérer avec l'humidité et le temps. Bonjours la galère si il faut verser ça! On en met partout.

Cordialement,
piwi

[MaliciaR]

Hello,

Inutile d'être cassant vis à vis des encadrant que nous ne connaissons pas. Merci pour eux.

Désolée, Piwi, mais quand tu as passé pratiquement 7 mois sans être encadré au minimum et en faisant des manips au hasard presque, tu considères encore davantage que d'habitude que quand une personne s'engage à encadrer un étudiant, elle s'y tient. La critique d'encadrant venait pour moi en 2e position dans ce que j'ai écrit, la première idée étant : si l'on ne sait pas comment faire, vaut mieux demander d'abord à celui qui est responsable à ce que l'on apprenne...

Ensuite le Tris n'est pas vendu sous la forme Tris. Il en existe deux types:
le Tris HCl
le Tris Base (ammonium)
Donc le Tris n'est pas nécessairement très basique comme tu l'affirmes.

Si tu regardes bien la formule que j'ai donnée, tu verras que je parle du Tris ammonium. Et donc c'est de lui que je fais ma prose

Le premier point est une évidence. Non pas pour la propreté de la boite mais votre santé.
J'ai plus de mal à cerner les tenants du second point. Si la spatule est propre je vois mal avec quoi on risque de tellement contaminer une boite. De toute manière, quand on veut peser la poudre il faut bien pouvoir la prendre. Ces poudres sont vendues par 500g ou par kg et ont tendance à s'agglomérer avec l'humidité et le temps. Bonjours la galère si il faut verser ça! On en met partout.

Cordialement,
piwi

Beh c'est vrai qu'on le garde dans un endroit sec, du coup il n'y a pas de cristaux ou de grumeaux qui se forment. Ce qui fait qu'on peut facilement verser de la poudre sans en mettre partout Mais je suis d'accord, il faut que la spatule soit vraiment nickel (eau pyrolysée + alcool avant l'utilisation) pour la mettre dedans (je suis dans un labo de paranos de propreté et ça me convient bien ).


Cordialement,

[invited71000a5]

Merci pour toutes vos réponses, c'est instructif, mais ne vous fachez pas...

Pour ce qui est des encadrants, en fait je vous explique ma situation :
Je ne suis pas étudiante, je suis en CDD dans un labo de recherche en physiologie de l'exercice, et on développe un labo de bio mol. C'est tout récent, et les personnes présentes au labo ne sont pas forécement spécialiste de bio, par contre moi j'ai fait des études de bio. Mais jusqu'à présent je n'ai pas manipé car je n'ai pas fait mes satges dans la bio mol. C'est pour ça que j'essaie de mettre en place cette nouvelle activité, c'est intéressant et en même temps je me forme à de nouvelles choses. Par contre n'ayant pas de spécialistes à côtés, voilà pourquoi j'essaie de trouver des conseils à droite à gauche sur internet...
Donc encore une fois merci pour les billesq que vous m'avez apportées.

Je vous donne la composition du Tris 1M pH 8.5 (25°C) (pour 1L)
Tris HCl: 44.2g
Tris Base: 87.2g
mettez, disons, 800 ml d'eau, ajustez le pH puis competez au volume exact.

Le Tris est une solution de base que l'on ne prépare pas au coup par coup. On en fait 1L et on le garde indéfiniment pour toutes les applications.

Sinon, dans mon cas (j'aurai peut-être du le préciser avant), je possède de la poudre Tris-HCl (Trizma hydrochloride 53.1 de Sigma exactement). Donc si j'ai bien compris, étant donné que cette poudre Tris-HCl a un PM = 157,6g, pour faire 1L de Tris-HCl 1M pH 8,5 :
Poudre Tris-HCl : 157,6g
Eau : 800 mL
J'ajuste le pH avec la soude
Et je complète avec de l'eau mon volume jusqu'à 1L

On est bien d'accord ?

[piwi]

C'est pas le mieux mais certains procèdent ainsi en effet.
Ajoutez de la soude très concentrée ou mieux encore, des pastilles de soude pure.

Cordialement,
piwi

[invite0addd10b]

bonjour
dans votre protocole il y a problème si je ne me trompe pas.
pour préparer du tris HCL 1M à un ph 8,5 il vous faut du HCl pour descendre le ph car la poudre mélangée à l'eau indique un pH au environ de 11.
je ne vois pas ce que viens faire la soude la dedans?
c'est complément faut

Voici mon protocole
preparation pour 1L TRIS HCl 1M pH 8,5

tris base( 121,14g/mol) 121,14g
H2O ajusté à 1L
tu prends un bêcher, tu ajoutes l'eau 800ml environ et ta poudre ; tu mélanges et tu regardes ton pH qui doit se trouver au environ 10 /11.
Tu descends le pH avec du HCl (conditionnement en bouteille tres toxique et l'utiliser ce produit sous une hotte aspirante).
A savoir avant d'ajuster l'eau bien attendre que ton tampon soit bien stabilisé et froid car la chaleur pour une solution que l'on prépare change après coup ton pH.
il reste à autoclaver ou filtrer ton tris-HCl.
Tris c'est une base et HCl un acide en mélangeant l'un à l'autre tu ajuste ton pH.

[Catrine8]

SVP, j'aimerai bien vous m'aider à savoir le rôle de quelques produits concernant une extraction de protéines tel que :Urée ,thio urée, Tris base, acrylamide,bis acrylamide, sucrose, APS, EDTA, DTT, KCl, PMSF, mercaptoethanol, acétate d'ammonium, TEMED, Glycerol, Glycine, chaps, SDS.