Primers dimers

[milkiway]

Bonjour,

En ce qui concerne le design de primers pour la qPCR, qui s'attarde sur les ∆G pour évaluer le risque de formation de dimers? Ceci n'est pas bien clair pour moi.

Je vous remercie!!!!!
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[Yoyo]

salut

c'est surtout ta question qui n'est pas tres claire...

YOyo

[milkiway]

Bonjour,

Au plus simple : référez vous à le page 17 du lienhttp://www.sigmaaldrich.com/Area_of_...cal_Guide.html.

Merci!!

[Yoyo]

Salut

Excuse moi ce n'est pas de la mauvaise volonté, mais la je trouve que tu abuses! tu veux meme pas te donner la peine d'expliquer plus clairement ta question, alors tu nous renvoies vers le catalogue sigma, a nous de le telecharger puis de rechercher la page en question pour ensuite deviner ta question...
on veut bien t'aider et etre sympa mais faudrait voir a ne pas exagérer quand meme! tu n'es pas au self-service ici!

Yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[milkiway]

Coucou,

Pardon, je ne voulais sûrement pas abuser!!!! Je ne connais pas trop la technique des forums, donc si je fais des "indélicatesses" il ne faut pas hésiter à me reprendre...

Dans ce catalogue d'utilisation de la qPCR, il est indiqué que l'on doit prendre en compte les DeltaG des primers (qui reflètent leur prédisposition à faire des hairpins ou duplex entre eux, des logiciels comme Net Primer le font) et cela surtout quand nous utilisons du Sybr Green. Je n'ai jamais entendu parler de cela avant c'est pourquoi je demande si des personnes en tiennent compte.

A+

[bam823543]

bonjour,
bien sur, tu dois en tenir compte dans le design de tes amorces,
mais des logiciels te donnent directement les chances de self annealing (boucle de l'amorce avec elle même) ou entre 2 amorces .
Tu travail avec du sybrgreen qui est aspécifique. Cela signifie qu'il va s'intercaler et ensuite fluoré entre chaque brun qui se forme, que ce soit tes dimères ou les brins que veut amplifier, ta quantification sera d'autant plus fausse qu'il y aura de dimères formés.
Donc moins tu as de chance d'avoir des dimères plus ta quanti sera proche de la réalité.

[gorben]

Salut,

Coucou,

Pardon, je ne voulais sûrement pas abuser!!!! Je ne connais pas trop la technique des forums, donc si je fais des "indélicatesses" il ne faut pas hésiter à me reprendre...

Dans ce catalogue d'utilisation de la qPCR, il est indiqué que l'on doit prendre en compte les DeltaG des primers (qui reflètent leur prédisposition à faire des hairpins ou duplex entre eux, des logiciels comme Net Primer le font) et cela surtout quand nous utilisons du Sybr Green. Je n'ai jamais entendu parler de cela avant c'est pourquoi je demande si des personnes en tiennent compte.

A+

Oui c'est tres important de ne pas avoir de dimere. Perso je rejette systematiquement les couples avec des deltaG negatifs ou des dimeres/duplex/hairpin de plus de 4.

Les dimeres sont a eviter et a rechercher dans TOUTES les techniques de detection, pas seulement le SG. Je dirais meme, que c'est pour le SG que c'est le moins important. C'est pas parce que les autres techniques ne les montrent pas qu'il n'y en a pas ! Ils affectent l'efficacite de la PCR et les quantifs ressortent fausses.
Il est d'ailleurs conseille de mettre au point la qPCR une premiere fois en SG, puis de passer a une autre methode de detection une fois que l'on est sur de ne pas avoir de dimeres.

A+

[milkiway]

Bonjour,

Merci pour vos réponses!!

A bientôt!!!