Bonsoir tout le monde,
Je ne comprends pas bien la différence entre une analyse colorimétrique et un test UV. Quelle est la différence entre les 2? Je pense que le dosage colorimétrique est un dosage à temps fixe alors que le test UV est un dosage par cinétique. Pourriez-vous me réexpliquer le principe de chacun et comment devons-nous choisir entre les 2?
Merci
Bonsoir (ou bonjour je sais plus lol),
Quand on fait un dosage enzymatique, on suit la production ou la disparition d'une molécule. Mais en fait tout dépend de la longueur d'onde à laquelle absorbe ta molécule. Si tu fait ta mesure en produisant une molécule colorée, tu es dans le domaine du visible et tu fais donc un dosage colorimétrique. Par contre, si tu mesures par exemple la production (ou la consommation) de NADH par une enzyme, tu fais ta mesure dans l'UV, vu que le NADH absorbe dans l'UV à 340 nm.
J'espère ne pas avoir répondu à côté ...
Merci Zellus pour ces précisions.
Donc, si par exemple, on veut doser l'acide lactique. On sait que l'acide lactique en présence de NAD+ donne du pyruvate et du NADH,H+. On réalise un test UV. Si on remarque une augmentation de NADH, on en déduit qu'il y a formation de pyruvate. Je suppose qu'on doit aussi calculer la concentration en acide lactique? Comment fait-on?
Merci pour ton aide qui me sera précieuse
D'abord il faut calculer la concentration C de NADH (en mol.L-1) formé grâce à la loi de Beer-Lambert :
Aλ = ελlC
où Aλ est l'absorbance du NADH à la longueur d'onde λ choisie (ici λ = 340 nm) que tu mesures au spectrophotomètre (sans unité),
ελ est le coefficient d'extinction molaire du NADH à la même longueur d'onde λ (en M-1.cm-1),
et l est la longueur du trajet optique traversé par le faisceau lumineux (il correspond à l'épaisseur de ta cuve, souvent 1cm).
Tu trouves donc la concentration de NADH et grâce à l'équation de la réaction catalysée par la lactate déshydrogénase (LDH), tu en déduis celle du lactate. Et vu que 1 mole de lactate est consommée pour donner 1mole de NADH, la concentration est la même. Attention après à ramener cette concentration à celle de ton échantillon de départ qui a généralement été dilué.
Mais pour être sûr d'avoir calculé la vraie concentration de lactate, il faut que la réaction catalysée par la LDH soit totale. Or, elle a plutôt tendance à tendre dans le sens de la formation de lactate. Donc il faut coupler une deuxième réaction à celle-ci qui permet de consommer tout le pyruvate formé. Pour cela on utilise par exemple la glutamate pyruvate transaminase.
Voilà j'espère avoir été clair !
Merci beaucoup Zellus.
Maintenant, je comprends mieux. Tu expliques vraiment très bien.
Bonne soirée et encore un grand merci pour ta patience
