Extraction proteines de champignon
bonjour les amis, voilà je suis mycologiste et j'ai jamais eu à faire une extraction de protéines avec une électrophorèse, j'ai beaucoup lu concernant les protocoles d'extraction, je souhaiterais cependant avoir un avis pratique de la part de ceux qui ont plus d'expérience sur la paillasse. merci
ben... tout dépend de ta protéine, recombinante ou pas, substrat potentiel d'une enzyme, son pHi, sa concentration, son activité enzymatique propre... et ca dépend aussi de ton champignon de départ ! il y des dizaines de protocoles complètement différents selon tous ces paramètres.
salut Josquin, oulala c'est vrais je n'ai pas précisé, en fait j'ai une quinzaine de souche à caractériser, pour cela je dois faire une extraction des protéines à partir de sclérotes (structures de conservation du champignon: petite masses noirs 2 à 5mm de diamètre), je dois doser la concentration des protéine, et après électrophorèse, je colore avec différents réactifs selon la nature de la protéine. ça me permet d'étudier la diversité de la population en fonction du profile protéique. pour le champignon il s'agit naturellement du botrytis
ouais... ben bon, je sais pas du tout, j'ai jamais fait ca ! désolé
c'est pas grave Josquin, merci d'avoir essayer!! par contre si quelqu'un d'autre a une idée, elle sera la bienvenue. merci encore Josquin
Salut,
Quand on sait pas vraiment comment faire faut y aller à tâtons et après améliorer le système.
Pour commencer tu pourrais par exemple prendre une sclérote (de même taille pour chaque souche pour pouvoir mieux comparer) que tu resuspends dans 1 mL de TE (Tris HCl 10 mM pH 7,5 et EDTA 1 mM) et tu centrifuges 5 min à 13200 rpm par exemple sur une centri de paillasse pour culoter les cellules. Ensuite tu vides le surnageant histoire de laisser que 40 µL de liquide au dessus de tes cellules et tu soniques un peu pour les lyser. Tu peux tester plusieurs temps de sonication pour voir ce qui est le mieux. Enfin tu rajoutes du Laemmli, tu cuis 5 min à 95°C et c'est prêt. ^^ Tu déposes genre 10 µL (tu peux faire aussi des dépôts de différents volumes pour voir ce qui donne le meilleur profil sur gel) de ton échantillon sur gel et tu verras bien ce que ça donne.
Mais c'est un profil des protéines totales que tu veux voir ou une protéine en particulier ?
Je ne connais pas vraiment le botrytis. Est-il possible de repiquer les sclérotes et d'en faire une culture liquide ?
salut, merci pour ta réponse, je vais essayer ce que tu m'a proposé, c'est en forgeant qu'on devient forgeron, pour le champignon, tu as raison on le cultive sur milieu solide ou liquide, quoi que la culture liquide soit plus contraignante (contaminations), l'idéale c'est de prendre des sclérotes et de les réduire en poudre avec de l'azote liquide et ensuite je peut essayer ce que tu m'a proposé
merci, pour l'idée, elle est géniale
à bientot
