Salut!
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1...ubmed_RVDocSum
Creation of human tumour cells with defined genetic elements.
(Hahn et al. Nature, 1999)
Ce travail est issu du laboratoire de Bob Weinberg au MIT, célèbre (entre autre) pour avoir découvert la mutation Ras V12 au milieu des années 80, et plus globalement pour être certainement le chercheur ayant le plus apporté à la cancérologie au cours des deux dernières décennies (même s’il n’est pas le seul, il reste incontournable). Cette publication plus tardive (1999) s’est très rapidement imposée comme étant une, si ce n’est LA, publication essentielle de la cancérologie moléculaire humaine. C’est la première étude qui a permise de « créer » une cellule cancéreuse humaine à partir d’une cellule humaine normale et surtout, à partir d’éléments génétique bien définis. Le raisonnement, comme beaucoup d’études de gros labos américains, est d’une simplicité et d’une clarté déconcertante à tel point que l’on se demande pourquoi personne n’y avait pensé avant eux (la simplicité est cependant uniquement apparente la plupart du temps et cache souvent de grosses difficultés techniques).
Le principe fonctionne par ajout d’éléments oncogéniques en observant l’effet de ces éléments sur certaines caractéristiques des cellules. Ainsi, deux oncogènes ont été utilisés soit séparément, soit ensemble : H-Ras G12V (H-Ras) et la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT). Deux lignées principales ont été utilisées pour cette étude : les HEK (Human Embryonic Kidney) et les BJ (human fibroblasts). Les cellules sont initialement modifiées par l’antigène T du SV40 qui ne permet pas de les immortaliser mais simplement de passer outre la sénescence (conditions indispensables pour la survie des cellules non immortalisées en culture).
Ce travail peut-être divisé en deux grandes parties.
La première partie de l’étude consiste à introduire les différents éléments dans les cellules HEK et BJ afin d’obtenir différentes lignées possédant H-Ras V12 et/ou Htert avec toutes les combinatoires possibles (-/-, - /+, +/- et +/+). Les expressions de l’Ag T et de H-Ras sont vérifiées par western-blot. L’ajout de la télomérase est validé par RT-PCR et son activité est contrôlée par southern-blot. Les télomères sont allongés dans les cellules modifiées par rapport aux cellules témoins.
La seconde partie du papier est dédiée à l’analyse des propriétés des différentes lignées créées.
Les auteurs réalisent tout d’abord des essais de prolifération en absence de substrat, propriété essentielle des cellules cancéreuses. La méthode utilisée est robuste et largement reconnue pour ce type d’expérience : les cellules sont cultivées dans de l’agar mou (ce qui pour la cellule, correspond à une absence de substrat) et les colonies formées sont comptées. Les résultats de cette première expérience sont nets : seules les cellules qui possèdent à la fois H-Ras et hTERT sont capables de former des colonies dans l’agar. Ce résultat est valable pour les cellules HEK et BJ. Cependant, une petite partie des cellules HEK possédant uniquement H-Ras mais sans la télomérase sont capables de proliférer dans l’agar.
La figure suivante est consacrée à la prolifération des cellules en culture. Seules les cellules immortelles sont capables de proliférer en culture et l’immortalité est également une caractéristique essentielle des cellules cancéreuses. Les auteurs suivent l’évolution de la population sur 125 jours. Là encore le résultat est impeccable : seules les cellules possédant la télomérase sont capables de proliférer en culture. Le statut de Ras n’a aucune influence sur cette prolifération ce qui indique que Ras ne joue pas de rôle majeur dans l’immortalisation des cellules. La double possession de l’Ag T et de la télomérase confère donc l’immortalité aux cellules.
La dernière figure intéresse la transformation tumorale en elle même (après avoir étudié l’immortalisation) et teste la capacité des différentes lignées à former des tumeurs in vivo chez la souris nude immunodéficiente. Les cellules HEK sont donc injectées dans les souris et le volume des tumeurs formées est mesuré régulièrement. Les souris sont sacrifiées lorsque la tumeur dépasse 1 cm de diamètre. Seules (et toutes) les souris à qui l’on a injecté des cellules positives pour H-Ras et hTERT développent des tumeurs.
Les auteurs concluent que l’expression ectopique de l’antigène T, de H-Ras G12V et de hTERT suffit pour convertir une cellule normale en une cellule tumorigène. C’est la première tentative réussi de transformation tumorale dans une cellule humaine.
Il faut toutefois signaler qu’une équipe avait déjà tenté l’expérience en transfectant des fibroblastes humain avec E6/E7 (qui inactivent Rb et p53, donc qui miment l’Ag-T), hTERT et Ras mais sans succès. Ceci est paradoxal avec les résultats de Weinberg dans la mesure où les mêmes voies sont sensées être stimulées ou inactivées dans les deux cas. Weinberg explique la différence par le fait que l’Ag-T, outre l’inactivation de Rb et p53, perturbe également d’autres pathways (contrairement à E6/E7) et suppose donc que parmi ces autres voies certaines doivent être altérées pour que la transformation tumorale se fasse….
V.
-----
Envoyé par gorben 
) que seules les HEK arrivent à former des colonies, à la différence des fibroblastes qui en sont incapables (puique étant des cellules différenciées) . A noter tout de même que les HEK ne forment pas de glorieuses colonies comparées à leurs consoeurs transfectées H-Ras/hTERT.
) mais ce n'est pas Bob mais Robert A. Weinberg...(Bob Weinberg existe mais c'est pas le bon vieux Robert).