hybridisation in situ et immunomarquage

[invite75b8241e]

Hello!
J'ai cloné un gène impliqué dans le développement du système nerveux central du poulet. Je fais une experience d'hybridisation in situ afin de determiner son _expression spatio-temporelle que je cherche à coupler avec une experience d'immunomarquage. Je ne vois pas trop comment coupler les deux experiences ensemble et surtout comment je fais pour produire mon anticorps?
Je pense que pour l'immunomarquage c'est plus simple que j'utilise un anticorps lié à un fluorochrome qui reconnait directement ma proteine. Mais quand est-ce que je place mon embryon dans la solution qui contient cet anticorps?
Merci d'avance pour vos réponses...
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[invite9e6bc039]

Quelque chose me dit que c'est pas vraiment toi qui a clone ce gene... mais que ca n'est qu'un enonce d'exercice

Petite correction: hybridisation in situ afin de determiner son _expression spatio-temporelle que je cherche à coupler avec une experience d'immunomarquage.

hybridisation in situ = immunomarquage.

Pour produire tes anti-corps, il suffit d'exprimer ton gene (si tu l'as clone, tu devrais l'avoir sur un vecteur) dans la bacterie par ex (avec une fusion GST ou MBP pour la purification)

[invite75b8241e]

En fait ce n'est pas cela que je voulais dire.
Avec mon hybridisation in situ, je marque les mRNA de mon gène.
Mon immunomarquage, c'est pour marquer les protéines que mon gène code... Parceque mes "niveaux" de mRNA et protéines peuvent très bien ne pas corréler entre eux et j'aimerai vérifier cela.
Merci beaucoup

[piwi]

ben tu fais ton ISH (les trois jours) ensuite tu peux marquer ta proteine.
Pour l'instant tu n'as mis que un anticorps anti-digUTP et anticoprs antiproteine normalement.

Maintenant arrive l'étape des fluorochromes que tu peux eventuellement mélanger (si possible!) ou faire à la suite le plus rapidement possible.
Et voilà.

Bon courage.

Mais sinon une méthode alternative pas plus mauvaise est de prendre deux lames succéssives coupées fines (moins de 5 micro si tu peux), si tu travailles sur lame, et de faire sur l'une l'ISH complete et sur l'autre ton immunomarquage des proteines. Tu devrais avoir à très peu de chose près la même image que tu pourras fusionner sur photoshop par exemple. (moins chiant pour la gestions des Igs ca!)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite75b8241e]

Merci beaucoup... Encore une petite question please!
Pour la production de mes anticorps anti-protéine, je ne vois pas trop comment faire. A la base, j'ai mon gène cloné...
Si je produis ma protéine dans une bactérie, il est possible que la protéine obtenue soit différente de celle trouvée chez le poulet (à cause de la différence des systèmes transcriptionnel et traductionnel entre la bactérie et le poulet) et que donc l'anticorps produit ne soit pas bien spécifique de ma protéine.
Peut-être que je peux utiliser la levure???
Merci encore.

[piwi]

oula non c'est pas comme ca qu'il faut faire!!
Tu vas trouver un epitope bien spécifique de ta proteine. Tu le surproduit et tu files ca à un lapin. Il va produire des anticorps polyclonaux contre ton epitope (ta proteine) et c'est eux que tu vas récupérer et utiliser (je simplifie, c'est le principe)
ensuite tu auras bien quelque part un anticorps secondaire monoclonal anti lapin avec un fluorochrome.

[piwi]

j'avais mal lu le problème.
Ben si dans une bactos ou une levure et tu pries.
De toute facon les modifications post traductionnelles ne seront jamais spécifiques de ton espèce donc bon... ejecta est!
Tu peux faire plusieurs polyclonaux pour en trouver un bon.

Ou alors faire des fractions monoclonales et les tester pour isoler le clone le plus efficace...
enfin ca bricole mais c'est bien le problème de la production d'anticorps.

[invite75b8241e]

justement mon probleme c est comment trouver l epitope specifique de ma proteine
merci...

[invite9e6bc039]

Tu as parfaitement raison quand tu dis que la machinerie transcriptionnelle est differente chez Coli, mais en general on essaye qd meme car c'est rapide et efficace.

Si ca marche pas tu peux l'exprimer chez des cellules d'insectes. C'est tres courant, ca marche bien mais plus complique

[invite75b8241e]

nouvelle question
on peut utiliser la technique du whole mount hybridisation chez l embryon de drosophile mais peut on le faire chez une drosophile au stade larvaire?

[piwi]

oui on peut...
simple rapide et efficace comme reponse non?

[invite75b8241e]

oui et je t en remercie
et quel controle utiliserais-tu pour verifier que la sonde est specifique ? un controle positif pour voir si mon experimentation a fonctionné serait de fabriquer une sonde pour un gene qui coderait pour l actine par exemple?

[piwi]

pour une hybridation in situ?
Quand tu fais ta sonde tu vas transcrire ton insert à partir de ton plasmide selon une origine de transcription antisens mais tu vas aussi faire la sonde sens (avec une origine de transcription dans l'autre sens. Normalement on s'arrange pour avoir les deux dans le plasmide pour les in situ) ce fera ton controle.

[inviteb73ce398]

justement mon probleme c est comment trouver l epitope specifique de ma proteine
merci...

Tout depend ce que tu cherches a faire. Si ta proteine n'est pas trop grosse, tu peux essayer de la produire entiere et de l'injecter au lapin entiere. Sinon, elle doit bien faire partie d'une famille de proteine. Si tu veux un anticorps specifique de ta proteine, tu fais un alignement et tu choisis un peptide divergent. Tu trouveras des infos sur ce site. Il devrait y avoir aussi des outils sur le web pour determiner les profils d'immunogenicite des peptides choisis.

Sinon, je pense que decoupler les deux manips hybridation in situ et immuno est nettement moins problematique. D'apres ce que j'ai pu entendre (jamais tenter personnellement), la combinaison des deux est au mieux, pas une partie de plaisir, au pire incompatible.

[invitefd278a8f]

J'ai un problème similaire.
Je réalise un immunomarquage avec un anticorps couplée au FITC qui va reconnaitre un marqueur membranaire.
Puis, je fais une hybridation in situ avec deux sondes qui vont reconnaitres chacunes une cible génomique différente.
Entre de ces 2 étapes, je traite les lames à la protéinase K qui permet de libérer l'ADN des protéines pour que que les cibles soient accessibles aux sondes.
Le problème est qu'apres ce traitement, qui est absolument nécessaire pour le FISH, je n'ai plus, ou tres peu, de signal membranaire. Par ailleurs le marquage entre l'isotype et l'anticorps d'intéret est équivalent...chose génante pour une amplification
J'ai essayé plusieurs temps d'incubation avec la protéinase ainsi que plusieurs concentration mais sans changement spectaculaire.
Je ne dispose que d'une lame par patient, je ne peux donc pas découpler les 2 manips.

[inviteb73ce398]

Le problème est qu'apres ce traitement, qui est absolument nécessaire pour le FISH, je n'ai plus, ou tres peu, de signal membranaire.

Ca ne me parait pas trop surprenant puisque la proteinase K est une protease (degrade donc ton anticorps et ta proteine membranaire d'interet...).

[invite9e6bc039]

Ca ne me parait pas trop surprenant puisque la proteinase K est une protease (degrade donc ton anticorps et ta proteine membranaire d'interet...).

+1 Ca me paraît vraiment bizarre d'utiliser la protéinase K

[piwi]

oula tu en fais deja des choses sur tes lames. Il reste quelque chose à la fin?
Ensuite c'est vrai que la PK c'est deja pas mal, c'est une enzyme plutot efficace quand même. Tu incubes à quelle temerature? Combien de temps?

[invitefd278a8f]

Nous avons bien sur fais des essais d'immunomarquage de fish sans PK.
Résultat : marquage membranaire correct mais très peu de signal en FISH. Nous en avons conclu que la pk est nécessaire pour le fish.

La PK est à 0.5 µg/ml et j'ai essayé ces différents temps, tous à température ambiente : 7min, 3min, 1min.
Une minute parait suffidant pour une bonne hybridation entre les sondes et leurs cibles.