Bonjour, cliquez-ici pour vous inscrire et participer au forum.
  • Login:



+ Répondre à la discussion
Affichage des résultats 1 à 9 sur 9

Extinction de l'expression de gènes par les siRNA : la découverte

  1. LXR

    Date d'inscription
    avril 2007
    Localisation
    Genève (CH)
    Messages
    3 898

    Extinction de l'expression de gènes par les siRNA : la découverte

    Bonjour,

    Duplexes of 21-nucleotides RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells (Elbashir et al., Nature, 2001) (Accès libre)


    Cet article est à l’origine de l’ARN interférence dans les cellules de mammifères en culture. La caractérisation de ce processus par Craig Mello et Andrew Fire chez le nématode leur a valu le Prix Nobel de Physiologie et de Médecine en 2006. Ici, les travaux de recherche ont été conduit par Thomas Tuschl qui, après avoir effectué un séjour post-doctoral chez Philip Sharp (Prix Nobel 1993 : découverte de l’épissage), a eu la brillante idée d’introduire directement des petits ARN interférents (siRNA) dans les cellules de mammifères en culture pour induire l’extinction (knock-down) de gènes cibles. Cela avait été montré chez d’autres espèces avec des ARN double brin (dsRNA), mais les tentatives étaient vouées à l’échec chez les mammifères.

    L’ARN interférence fut étudiée chez C. elegans dans les groupes d’Andrew Fire et Craig Mello, après la découverte de ce processus chez le pétunia (Napoli et al., Plant Cell, 1990). Ils ont fortement approfondi le sujet et ont clairement défini le principe de l’ARN interférence en 1998 (Fire et al., Nature, 1998) : l’introduction d’ARN double brin dans les cellules de nématode provoque une extinction efficace et spécifique de l’expression du gène cible. L’ARN interférence était déjà utilisée sur C. elegans ainsi que sur la drosophile pour étudier la fonction de gènes. En revanche, l’introduction d’ARN double brin de 38 à 1662 nucléotides dans des cellules de mammifères en culture déclenche une dégradation non spécifique de tous les ARNm cellulaires (Ui-Tei et al., FEBS Lett., 2000) aboutissant à la mort de la cellule : c’est la réponse interféron. Cette réponse est un mécanisme de défense antiviral développé par les mammifères, qui empêche l’utilisation de l’ARN interférence chez cette famille.

    Une piste inattendue va toutefois se dévoiler grâce à des travaux sur la drosophile. En travaillant sur des extraits d’embryons de drosophile, le groupe de Thomas Tuschl a pu constater que les ARN double brin sont clivés en de petits fragments d’ARN double brin de 21 à 23 nucléotides qui conduisent au clivage de l’ARNm cible à des intervalles de 21 à 23 nucléotides (Zamore et al., Cell, 2000). Ils ont donc pensé que ces petits fragments d’ARN double brin sont responsables du clivage spécifique de l’ARNm cible : ce sont les petits ARN interférents (siRNA). Leur hypothèse fut confirmée sur des extraits d’embryons de drosophile où l’introduction de siRNA éteint l’expression du gène cible (Elbashir et al., Genes and Development, 2001). Il ne reste alors qu’un pas décisif à franchir pour montrer que les siRNA sont capables d’éteindre des ARNm cibles de façon spécifique au sein de cellules en culture.

    Dans une première série d’expérience, Elbashir et al. se sont concentrés sur l’extinction de gènes rapporteurs (Luciférases GL2, GL3 et RL) par des siRNA spécifiques de chacun, dans des lignées cellulaires de Drosophile (S2), de souris (NIH3T3), de singe (Cos-7) et humaines (HeLa, HEK293). Ils ont donc procédé à des co-transfections à la lipofectamine : pGL2/pRL ou pGL3/RL, avec les différents siRNA et ont regardé les activités luciférase 24 heures après transfection. Dans toutes les lignées cellulaires, on observe une extinction spécifique et efficace (sauf pour les HEK293) des gènes rapporteurs ciblés par leur siRNA respectif sans affecter l’activité des autres rapporteurs. Malgré la forte homologie observée entre GL2 et GL3 (95%), l’extinction est spécifique pour chacun d’eux. Les siRNA permettent donc d’obtenir un knock-down ciblé de gènes rapporteurs dans des cellules de mammifères sans induire la réponse interféron.

    Afin de savoir si la taille des ARN interférents constitue le facteur de réussite de l’ARN interférence dans les cellules de mammifères, les auteurs procèdent à la co-transfection pGL2/pRL dans les cellules HeLa avec des dsRNA de 50 ou de 500 nucléotides. Comme contrôle d’extinction non spécifique ils prennent un dsRNA ciblant la GFP humanisée. Avec les deux tailles de dsRNA les auteurs obtiennent des extinctions non spécifiques de GL2. Elbashir et al. suggèrent que la réponse interféron est à l’origine de l’absence de spécificité de ces knock-down.
    En normalisant l’activité GL2 en présence des dsRNA GL2, GL3 ou RL par rapport à son activité en présence du dsRNA hGFP, ils observent une spécificité de l’extinction, mais imprécise puisque dsRNA GL3 éteint GL2 avec la même efficacité que dsRNA GL2. Dans ce cas, la spécificité doit être vue comme une dégradation plus intense pour l’ARNm ciblé que pour l’ensemble des ARNm de la cellule. La taille des ARN interférents est donc la clé de la réussite d’une extinction très spécifique des gènes rapporteurs dans les cellules de mammifères sans affecter l’expression des autres gènes.

    Dans une dernière expérience, les auteurs s’attachent à valider leur méthode sur des gènes endogènes exprimés. Ils décident donc d’utiliser des siRNA ciblant l’ARNm des lamine A/C, de la lamine B1, de NuMa et de la Vimentine, et de regarder par immunofluorescence l’expression de ces gènes 40 heures après transfection. La figure concernée ne montre que le résultat obtenu avec le siRNA Lamine A/C où on voit une forte diminution du marquage cellulaire par l’anticorps anti-Lamine A/C sans affecter le marquage par l’anticorps anti-NuMa. Ce résultat est confirmé par western blot pour les lamines A et C. La méthode de transfection de siRNA dans les cellules de mammifères permet donc une extinction spécifique et efficace de gènes endogènes exprimés.

    En conclusion, les auteurs orientent les futures recherches sur les mécanismes d’ARN interférence dans les cellules de mammifères et introduisent aussi la possibilité d’utilisation de cette méthode simple dans les laboratoires et le développement thérapeutique.
    L’impact de ce papier, qui a été cité 5507 fois, est immense puisqu’il concerne plusieurs disciplines de la biologie. En effet, cette méthode permet d’accéder à une information proche d’un knock-out sur cellule mais avec peu de moyens et une facilité très attrayante. Désormais, peu d’articles utilisant la culture cellulaire arrivent à se passer de son utilisation, et les revues la demandent de plus en plus aux équipes de recherche.

    Greg


    "Happiness only real when shared" - Christopher McCandless -
     


    • Publicité



  2. Yoyo

    Date d'inscription
    janvier 2003
    Messages
    15 243

    Re : Extinction de l'expression de gènes par les siRNA : la découverte

    Salut

    Merci pour ce tres bon résumé.

    Quand meme, je suis moyennement d'accord sur le fait qu'un siRNA est similaire a un KO. Pour avoir expérimenté cela au labo, il est clair qu'en expression transitoire le taux d'inhibition de la synthese protéique est loin d'etre maximale, et meme si on cree une lignée stable exprimant le siRNA on n'arrive pas non plus a 0.
    Ensuite ce qui me semble surprenant est la nécessité de devoir tester plusieurs siRNA pour en trouver au moins un qui marche. Ca signifie quand meme qu'il nous manque des informations et que les regles de fonctionnement ne sont clairement pas totalement comprises, puisqu'on n'est pas totalement prédictif.

    je vais dévier un peu en rebondissant sur les petits freres, les miRNA
    Ce qui est quand meme étonnant est la rapidité avec laquelle les miRNA (la contre partie naturelle des siRNA) sont devenus essentiels a tous (ou presque) les mécanismes de la cellule. Or quand on regarde de plus pret on s'appercoit que dans la plupart des cas le liens entre le miRNA et le phénotype est assez faible. Ca releve plus de la corrélation que de la démonstration et parfois certains articles donnent l'impression de monter des théories générales batties sur un chateau de carte, tellement les preuves sont faibles de l'action du miRNA concerné. Chez C. elegans il y a plusieurs cas bien décrit et ou les résultats sont solides, mais pour le reste a l'exeption de 2 ou 3 miRNA j'ai l'impression que c'est loin d'etre si solide que ca.
    D'ailleur on se retrouve vite ennuyer si on cherche a determiner les miRNA potentiels qui reguleraient un gene précis, car les programmes de recherches informatiques donnent entre 10 et 30 miRNA candidats... c'est tout simplement impossible a tester!...
    tout ca pour dire que c'est en effet une decouverte fantastique, mais qu'il serait sans doute prudent de ne pas trop extrapoler certains résultats et ne pas faire jouer aux miRNA des roles qu'ils ne jouent pas.

    YOyo
    Dernière modification par Yoyo ; 25/02/2009 à 11h23.
     

  3. piwi

    Date d'inscription
    janvier 2005
    Localisation
    Strasbourg
    Âge
    37
    Messages
    7 857

    Re : Extinction de l'expression de gènes par les siRNA : la découverte

    C'est effectivement important de souligner que l'on ne parvient pas au KO total mais au mieux à un hypomorphe-like. Or l'hypomorphe ne récapitule pas nécessairement le KO en moins grave. Alors il faut bien avoir en tête ce que l'on regarde sinon les conclusions ne veulent pas dire grand chose.
    La difficulté des siRNA vient du fait qu'ils doivent avoir une conformation secondaire assez stricte pour pouvoir être processés et produire leurs effets. Or on est assez pauvre en outils prédictifs de repliements secondaires pour les ARN, du coup on bricole et on tatone. Personnellement je connais mfold comme programme de prédiction et c'est tout. Le problème n'est pas sépcifique à l'interférence ARN. On a le même problème en in situ où il nous faut souvent tester plusieurs sondes avant d'en trouver une qui hybride bien ce que l'on souhaite. D'ailleurs, en in situ on a régulièrement à faire à du bruit de fond, résultat d'hybridations aspécifiques. Qu'en est il pour l'interférence ARN? Comment établir la spécificité de la réaction?

    Enfin, même remarque que Yoyo. Dans l'euphorie de la découverte, on nous a collé des miRNA partout. La tension est en train de retomber et chacun est un peu en train d'en revenir et de voir ce qui se passe réellement (enfin, c'est la tendance que je sens.)
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
     

  4. Yoyo

    Date d'inscription
    janvier 2003
    Messages
    15 243

    Re : Extinction de l'expression de gènes par les siRNA : la découverte

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    D'ailleurs, en in situ on a régulièrement à faire à du bruit de fond, résultat d'hybridations aspécifiques. Qu'en est il pour l'interférence ARN? Comment établir la spécificité de la réaction?
    je trouve cette remarque tres perninente car il ne me semble pas que les auteurs se soucient de ce point la, en tout cas je n'ai jamais vu d'étude de spécificité, mais je ne suis pas non plus un spécialiste du siRNA. Au mieux on s'assure que l'effet n'est pas général en prenant un gene témoin, il me semble.
    Enfin, même remarque que Yoyo. Dans l'euphorie de la découverte, on nous a collé des miRNA partout. La tension est en train de retomber et chacun est un peu en train d'en revenir et de voir ce qui se passe réellement (enfin, c'est la tendance que je sens.)
    sentiment partagé donc

    Yoyo
     

  5. LXR

    Date d'inscription
    avril 2007
    Localisation
    Genève (CH)
    Messages
    3 898
    Pour la comparaison du knock-down avec le knock-out, je voulais juste rapprocher les deux techniques au niveau conceptuel, en sous-entendant que les deux techniques tendent vers 0, le KO étant plutôt =0...

    Il est vrai qu'avec une transfection transitoire avec les siRNA, on observe une extinction de 90% maximum. Cela suffit souvent à constater un changement phénotypique, pouvant rappeler le KO (décidément j'y tiens ). L'avantage se situe surtout au niveau de l'accessibilité de l'information. Avant les siRNA, on se tatait entre les inhibiteurs pharmacologiques (lorsqu'ils étaient disponibles) et les dominants négatifs, pouvant invalider certaines fonctions d'une protéine mais pas d'autres. La forte diminution d'expression causée par les siRNA rend les travaux plus souples.

    Du point de vue de l'ARN interférence naturelle (miRNA), les recherches sur les miRNAs ce sont très (trop) emballées. Surtout que la tendance est : découverte d'un miRNA = gros papier. La carotte est de taille, beaucoup de labos suivent. C'est la meilleure façon de provoquer des expériences foireuses...Se fier à 100% à des gros papiers sur des miRNAs est peut-être un peu prématuré en l'état actuel des connaissances. Donc je rejoint ce que vous dites.

    Pour le papier, ils ont considéré que l'expérience éteignant spécifiquement GL2 et GL3, malgré la forte homologie de ces deux gènes, suffisait à démontrer qu'un siRNA n'éteint que son gène cible. Du coup c'est léger quand ils passent sur des gènes endogènes, ils ne font pas de contrôle avec des gènes fortement homologues, dommage... Je ne sais pas si des puces Affymetrix ont été faites sur des extraits de cellules transfectées avec un siRNA d'intérêt dans d'autres papiers. C'est sans doute trop fort comme approche pour s'assurer que le siRNA ne touche qu'à son gène cible mais c'est la seule que je vois pour avoir une vision globale de l'expression génique. Le problème est que dans les puces il y a beaucoup de biais sur les interprétations.

    Au niveau de l'explication du phénomène d'interférence, les structures de protéines impliquées dans ce processus ont fait leur apparition récemment dans le groupe de Tuschl. Cela pourrait ouvrir des pistes sur la connaissance des structures secondaires du siRNA responsables de l'extinction du gène cible.

    Greg
    Dernière modification par LXR ; 26/02/2009 à 00h56.
    "Happiness only real when shared" - Christopher McCandless -
     


    • Publicité



  6. Yoyo

    Date d'inscription
    janvier 2003
    Messages
    15 243

    Re : Extinction de l'expression de gènes par les siRNA : la découverte

    salut

    peut etre que si certains ici ont l'habitude d'utiliser les siRNA ils pourraient expliquer comment ils s'accomodent des problemes de spécificité?

    YOyo
     

  7. LXR

    Date d'inscription
    avril 2007
    Localisation
    Genève (CH)
    Messages
    3 898

    Re : Extinction de l'expression de gènes par les siRNA : la découverte

    Les problèmes de spécificité ne sont pas spécialement recherchés. Ils peuvent exister mais difficile de connaitre leur fréquence étant donné qu'on ne regarde pas, la plupart du temps, si l'expression de protéines autres que celle d'intérêt est affectée. Je pense que les gens travaillant sur des protéines à forte homologie regardent la spécificité de leur siRNA sur les différents homologues, en dehors de ces cas là, certainement peu de personnes le font.

    Pour ce qui est de mon cas : je travaille sur deux protéines ayant un fort pourcentage d'homologie puisque ce sont des isotypes. J'ai la chance d'avoir un isotype ubiquitaire et l'autre ayant un profil d'expression tissu-spécifique. Dans les types cellulaires sur lesquels je travaille pour le moment, je n'ai que l'isotype ubiquitaire qui est exprimé, donc que cette forme à éteindre, et je ne regarde pas si je croise avec d'autres protéines. Dans le cas où je serais confronté à un type cellulaire exprimant les deux isotypes, pour un siRNA ciblant un des deux je regarderais alors systématiquement l'expression des deux isotypes pour m'assurer que je ne touche qu'à un seul. Je pense que ma démarche est largement répandue parmi les utilisateurs de siRNA.

    Greg
    "Happiness only real when shared" - Christopher McCandless -
     

  8. gorben

    Date d'inscription
    avril 2005
    Localisation
    Bethesda, USA
    Âge
    34
    Messages
    1 109

    Re : Extinction de l'expression de gènes par les siRNA : la découverte

    Salut,

    Je suis un peu novice sur ce genre de methode, est ce qu'on sait comment est ce que ca marche concretement? Pourquoi ne pas utiliser des ARN simple brin?
    Je me pose la question, parce que chez les procaryotes je n'ai jamais entendu parler d'une reposonse de ce genre. En revanche, les regulations via sRNA (small RNA) font generalement intervenir un ARN simple brin qui va soit masquer le RBS (initation traduction), soit former une structure II dans l'ARN et de la meme maniere (terminaison precoce transcription/traduction).

    A+
     

  9. ibliss11

    Date d'inscription
    juin 2009
    Messages
    33

    Re : Extinction de l'expression de gènes par les siRNA : la découverte

    Bonjour,

    Il me semble que la première observation du processus peut aussi être attribuée à Stuitje :

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2...gdbfrom=pubmed

    Au passage, je n'ai jamais compris pourquoi beaucoup de découvertes se faisaient en même temps à minimum 7000 km d'écart... (je n'attends pas de réponse)
    Dernière modification par LXR ; 17/11/2009 à 20h44. Motif: correction lien
     


    • Publicité





 

Discussions similaires

  1. Réponses: 16
    Dernier message: 03/12/2011, 16h37
  2. [Biologie Moléculaire] Régulation de l'expression des gènes
    Par nyogoso dans le forum Biologie
    Réponses: 3
    Dernier message: 22/05/2008, 22h04
  3. [Génétique] extinction de gènes
    Par gaellesibelle dans le forum Biologie
    Réponses: 2
    Dernier message: 28/12/2007, 20h52
  4. Inactivation de l'expression des gènes par RNAi ?
    Par Djelaba dans le forum Biologie
    Réponses: 3
    Dernier message: 03/01/2006, 18h56

Les tags pour cette discussion