Visualisation d'une cellule apoptotique....

[Vinc]

Salut à tous!
Je bosse en ce moment sur la mise en apoptose de cellules cancéreuses et il va nous falloir faire face à un petit problème technique!
Je vous explique!
J'induis l'apoptose dans mes cellules (qui sont pour l'instant des NG108.15 neuroblastome) et le but est de pouvoir "patcher" ces cellules anviron 4 à 6 heures après l'induction afin de pouvoir enregistrer les courants chlorures pendant le processus apoptotique....Jusque là, pas de gros problème!
Mais, il va nous falloir visualiser quelles cellules sont en apoptose et quelles cellules ne le sont pas (nécrose,...)! Cette visualisation ne poserait pas de problèmeparticulier si on se foutait du sort des cellules après la visualisation, mais le problème (j'y arrive enfin ), c'est que l'on doit maintenir nos cellules vivantes pour pouvoir les patcher (Patch-clamp)!

Or, toutes les techniques de visualisation par fluorescence (que nous aurions aimé utilisé) necessitent de perméabiliser la membrane (pour faire rentrer le fluorochrome) ou de fixer les cellules! Donc dans les 2 cas on tue la cellule! J'aurais voulu utiliser des techniques classiques comme le DAPI, le TUNEL ou le iodure de propydium couplé à l'acridine orange, mais je pense qu'il faut perméabiliser pour ces 3 techniques! Sinon il y a bien un substrat fluorescent de caspase, mais il faut certainement perméabiliser aussi! On a aussi pensé à l'Anexine 5 mais il me semble que ça ne va pas faire la distinction entre les cellules nécrotiques et les cellules apoptotiques (puisqu'il y a du FLIP-FLOP des phosphatidyl serine, dans les 2 cas = la membrane est fragilisée dans les 2 cas!)

Donc je pense que vous voyez mieux mon problème..........
Si vous avez des idées, n'hésitez pas!
A+ et merci d'avance pour les réponses éventuelles!
Vinc
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[invite9e6bc039]

Salut !!

Je travaille a peu pres sur la meme chose, mais sur C.elegans.

Question: est-il possible de les reconnaitre tout simplement en DIC (nomarsky) ? Nous, on fait comme ca.

Tu pourrais t'entrainer a les distinguer dans un premier temps avec des marqueurs classiques (tu bascules entre fluorescence et nomarski sur ton microscope), perso, j'ai fait comme ca, et maintenant je les reconnais sans probleme.

Sinon, as-tu pense a transfecter tes cellules avec une construction GFP ? Parce que dans ce cas, tu ne permeabilises pas tes cellules.

Autre point: acridine orange ca tue pas les cellules !! Ici on fait meme des screen genetiques a l'A.O. sur des vers entiers et ils survivent.

[Vinc]

Salut!
Qu'est ce que tu appelles DIC??? Je ne connais pas!
En fait, pour l'instant je les met en apoptose et je regarde les changements morphologiques de mes cellules et c'est clair qu'elles sont apoptotiques! Pour l'instant je fais ça sans marqueur pour voir si ça marche et pour tester mes doses de staurosporine!
Mais bon, mon but c'est d'avoir un marqueur qui me permette de voir au premier coup d'oeil si la cellule est apoptotique ou pas! Ca pourrait le faire le iodure de propidium/acridine orange et en plus cette technique distingue bien nécrose et apoptose avec nécrose en rouge et apoptose en vert je crois, ou l'inverse.....
Mais le problème c'est qu'apparement il faut perméabiliser la membrane et ça fragilise grandement l'équilibre de la cellule! Et comme en plus derrière je veux les patcher, il faut une membrane de bonne qualité sinon je pourrai jamais avoir un sellement correct! En fait, c'est pas l'acridine orange qui tue les cellules, c'est le fait de perméabiliser......Mais j'aimerai bien savoir si toi justement tu as eu besoin de perméabiliser ou pas! (dis moi non je t'en supplie )!

Pour ce qui de la transfection GFP, on y a pensé pour autre chose! Mais dans ce cas de figure tu veux qu'on transfecte quel gène???
En plus on s'attache à ne pas modifier le génome de nos cellules! Le but ultime est de faire ces manips sur des MCF7 qui ne possèdent pas la caspase 3 et qui ne peuvent pas entrer en apoptose après exposition à la staurosporine! On pourrait très bien transfecter la caspase mais comme on ne veut pas toucher au génome on va utiliser un inducteur apoptotique (acide rétinoïque) qui permet d'induire l'apoptose même avec l'abscence de la caspase 3!!!!

N'hésites pas si tu as d'autres idées!
A+
Vinc

[invite9e6bc039]

Hello

DIC=Nomarski (differential interference contrast)

En gros tu vois tes cellules en 3D, je suis certain que tu as ca sur ton microscope. Chez C.elegans on reconnait les cellules apoptotiques de cette maniere, car le contraste de la membrane change. Je suis presque convaincu qu'il est possible de faire de meme sur tes cellules, c'est principalement une question d'entrainement.

Sinon je confirme, on ne permeabilise pas les cellules pour l'A.O parce qu'on traite les vers entiers et ils survivent sans probleme.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite9eab997a]

Salut,

moi en FACS j'utilise le DAPI et le Hoechst et je n'ai pas besoin de permeabiliser. Ca me permet de trier les cellules et de les remettre en culture ensuite et mes MLR marchent nickel.

[invite2a651650]

bonjour,

tu ne peux pas selectionner ta population d'interet avec un FACS trieur?
apres un marquage iodure de propidium / annexin V ( sans permeabilisation)

tes cellules apoptotiques seront IP - et Ann V + tandis que les cellules necrotiques seront IP + et Ann V +
(sans parler des cellules "normales" IP - et Ann V -

a suivre...

[inviteb03dc14c]

En regle generale le tri par cytometrie acheve les cellules apoptotiques... Enfin toutes les cellules apoptotiques que j'ai trie...

Tu peux effectivement suivre les cellules apoptotiques sans les trier avec l'annexine 5 et l'IP. Il suffit de regarder les cellules annexine5 positives IP negatives.

Sinon certaines cellules apoptotiques presentent un marquage IP intermediaire entre negative et positive, c'est aussi a tester. Il suffit de rajouter a ta culture de l'IP sans permeabilisant.