Dot blot

[invite53e9773b]

Bonjour,
pouvez-vous me donner quelques limites d'utilisation de cette technique?
Merci
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[Vinc]

Bonjour!
On ne sépare pas les protéines et la détection peut s'en trouver altérée (augmentation du bruit de fond notamment). Il n'y a pas d'électro-transfert et de ce fait la fixation des protéines sur la membrane est plus faible. On ne peut pas observer de shift de migration ou des migrations à des poids moléculaires aberrants et il est donc impossible de visualiser les modifications post-traductionnelles en utilisant un anticorps dirigé contre la forme totale.
J'ajouterai que les échantillons contenant du SDS sont plus difficiles à caractériser en dot-blot de part leur dispersion sur la membrane, due à des phénomènes de tension de surface.

C'est rapide et facile, cela permet d'avoir une première réponse, mais ce n'est pas très rigoureux (en particulier à cause de l'absence d'électro-transfert).

V.

[piwi]

Je n'irai pas dire que ce n'est pas rigoureux. On peut faire un dot blot avec rigueur mais ce ne sera jamais un western blot.

Cordialement,
piwi

[Vinc]

Je dis que ce n'est pas aussi rigoureux qu'un western parce que les protéines ne sont pas solidement ancrées dans la membrane et si un jour tu as l'occasion de faire un western et un dot-blot en parallèle hybridés avec le même anticorps tu pourrais avoir des surprises comme cela m'est arrivé...

V.

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Je l'ai déjà fait et effectivement il y avait une surprise. J'avais un signal sur le dot et rien sur le WB.

[Vinc]

D'où ma remarque sur le bruit de fond du au fait que l'on ne sépare pas...

V.

[piwi]

Mais il se trouve quand dans mon cas le signal était spécifique (contrôle avec un mutant nul). Un anticorps peut fonctionner en dot et pas en WB. Ce qu'il y a avec le dot c'est que vous n'avez pas d'information fine. Vous pouvez dire que la protéine est là et parfois quantifier. Pas d'information de taille, pas de shift éventuel.