Extraction d'une protéine nucléaire pour WB

[invite34831b98]

Bonjour,

Voilà je cherche à quantifier (methode semi quantitative) un recepteur aux stéroides présent chez le rat (dans le cerveau) d'environ 100KDa.
J'ai d'abord commencer à faire une extraction au SDS (plus cocktail d'inihibiteur), j'ai aussi essayé tampon d'extraction classique (Triton, Glycerol, NaCl, EDTA, anti protéases). Apres dosage et dilution dans lameli, j'ai fait un WB (migration sur gel 10% SDS; puis transfert semi sec, mbr nitrocellulose 0,45µm, blocage lait 5% TBST, Ac primaire ON).
Le probleme c'est que ma protéine est pas très exprimé et les anticorps ne sont pas de très bonne qualité (et les tampons d'extraction pas forcement les meilleurs), au final j'ai beaucoup de non spécifique, pas beaucoup de signal au niveau de ma bande!
Est ce que quelqu'un aurait quelques conseilles pour ce genre de cas?
Est ce qu'une extraction fractionnée serait préférable?
Cordialement,

Merci,
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[Yoyo]

Salut

un conseil pour les grosses protéines comme la tienne, il est recommandé de faire un transfert sur la nuit (ca transfert tres mal).
Je pense que ton probleme principal est la taille de la protéine.

YOyo

[invite34831b98]

merci du conseil! J'ai déjà essayé de mettre au point le temps de transfert! En semi sec et avec l'appareil de transfert qu'on a (appareil bio-rad, petit gel, epaisseur du gel 1mm max) 1h de transfert fait passer les prot sur le papier wattmann! Mais peut être qu'a l'époque j'avais pas regardé si haut donc cela coute rien de remettre cela au clair!