Bonjour à toutes et à tous.
Je rencontre depuis plusieurs temps de gros soucis pour réaliser ma mutagénèse dirigée alors je me décide à vous en parler...tout idée est la bienvenue.
Voilà, j'ai un plasmide de 10Kb dans lequel je souhaite insérer 3 nucléotides à un endroit bien particulier pour créer un site de restriction. Une fois ce site de restriction présent j'insèrerai mon tag Flag. L'un des points limitant c'est que je souhaite insérer flag dans une boucle extracellulaire courte de ma protéine finale. Donc pas trop de marge de manoeuvre au niveau du DNA.
Je me suis lancée dans une mutagénèse avec le kit LIGHTNING de Stratagène, designé des primers complémentaires (33pb)sur leur site selon leurs caractéristiques comportant mes 3 nucléotides, varié les concentrations en DNA lors de la PCR , la température d'annealing, les temps d'annealing et d'élongation, le nombre de cycles...bref, j'ai tout essayé, je vous raconte pas le temps que ça m'a pris. Les quelques bactéries rarements obtenues après transfo et action de la DpnI, ne poussaient pas ou très mal en milieu liquide, et quand miracle il y avait, elle contenait...que dalle! Contaminations résistantes à l'ampicilline (gène de résistance dans mon plasmide)..?
J'ai passé le relais à ma collègue qui gère la plateforme de BM, idem pour elle avec le kit XL de stratagène également.
J'ai fait de nombreuses haltes par le forum ici pour comparer et comprendre ce qui ne fonctionne pas, mais toujours rien.
Changement de stratégie:
L'idée maintenant c'est d'amplifier un fragment plus court (environ 3Kb) compris entre deux sites de restriction uniques (mais toujours autour de la zone qui m'intéresse bien entendue). Donc pour cela je design 2 paires d'oligos et réalise 3 PCR successives..
PCR 1 : je génère le fragment en amont de ma mutation et la mutation se retrouve à l'extrémité 3'
PCR 2: je génère le fragment en aaval de ma mutation et la mutation se retrouve à l'extrémité 5'
PCR 3: je pool les deux premiers produits de PCR qui vont s'hybrider au niveau de la mutation et j'élongue grâce aux primers les plus extrèmes... ça va vous me suivez?
Là arrive mes questions.
Je n'ai absolument aucune expérience sur cette 2è stratégie que je ne connais que de façon théorique.
1) Si PCR 1et 2 génèrent des fragments de tailles très différentes (500 et 2500 pb), cela n'a pas d'importance? A priori non mais bon...
2) Si, soyons fou, je décide d'insérer Flag flanqué de mon site de restriction (le but est de pouvoir ensuite changé le tag comme bon me semble..quand on est fou on est fou!) tout entier à la place des 3 nucléotides et donc d'avoir dans mes primers "centraux" une extrémité libre strictement non complémentaire (pas d'hairpin et tout le bazar non plus)...est ce que l'encombrement risque d'être trop important, est ce que je débloque à fond les ballons..?
3) Si mes primers les plus extrèmes contenant les sites de restriction uniques du plasmide ont leur séquence commençant directement par ces sites de restriction uniques, y a t-il trop de risques qu'ils soient modifiés (et donc que je perde mes sites de restriction) par une enzyme qui perdrait de sa fidélité justement là où je veux pas...c'est tiré par les cheveux mais bon, j'aimerais avoir votre opinion.
Merci d'avoir tout lu...j'espère avoir été suffisemment explicite.
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Envoyé par Manillelab 
