Intérêts du NaDOC, SS DNA, chelex, Tris Cl dans plusieurs expériences

[invite8bb0d20c]

Bonjour à tous !

Actuellement en stage en laboratoire et en pleine rédaction de mon rapport, je cherche des informations sur le net pour pouvoir rendre mon compte rendu le plus complet, mais certaines de mes questions restent sans réponse...

Je réalise des ChIP (chromatin immunoprecipitation), et après extraction de l'ADN sur lequel les protéines ont été crosslinkées au formaldehyde, l'ADN est dans un tampon dit d'immunoprécipitation. celui-ci contient du NaDOC... à quoi cela sert-il ???

Aussi, les billes magnétiques qui servent à récupérer les parties constantes des anticorps après immunoprécipitation sont tout d'abord saturées avec de l'adn soniqué de sperme de saumon. pourquoi ?

Après immunoprécipitation, le reverse crosslink est effectué avec du chelex. comment cela fonctionne ? est-ce que les anticorps restent accrochés aux billes ou est-ce qu'ils sont en solution avec les protéines (par la suite dégradées avec de la protéinase K) ?

Et pour finir, question toute bête sans doute... le Tris Cl ph8 que je retrouve un peu partout sert "seulement" à maintenir un certain pH tout au long des manipulations ?

Voilà toutes mes questions...
En espérant que vous puissiez m'aider !
Merci beaucoup !!

Veuillez choisir un titre explicite comme l'exige la Charte que vous avez lue et acceptée en vous inscrivant.

LXR
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[nowell]

Bonjour

Je ne connais pas suffisement les protocoles que vous utilisez, cependant l'utilisation de Tris Cl sert milieu tampon. Il permet de conserver un ph régulier durant toutes vos expériences. Ainsi, travaillant avec de l'adn et des protéines, tous deux très semsibles aux changements de ph, vous évitez des dénaturations.


Bien à vous.

[nowell]

J'oubliais,

Le Nadoc permet à la chromatine de précipiter et d'être exploitée.

Et je peux vous conseiller une thèse publiée qui pourrait éventuellement vous apporter des détails non négligeables:

http://www.unige.ch/cyberdocuments/t...audN/these.pdf

Cherchez à la page 38

[invite8bb0d20c]

Merci beaucoup pour vos réponses nowell !
en ce qui concerne le NaDOC comment cela fonctionne-t-il, pourquoi permet-il la précipitation de l'ADN ?

Si quelqu'un pouvait m'aider en ce qui concerne les billes et le chélex...

Merci encore !

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8bb0d20c]

Après lecture de certains sites, le chélex lie les ions nécessaires à l’action des nucléases, ce qui protégé l’ADN pendant le chauffage à 99°C effectué lors du reverse crosslink.
C’est donc en fait la température qui va reverse crosslinker les protéines de l’ADN, le chélex étant là pour protéger l’ADN des nucléases, si j'ai bien compris.....

[invite8bb0d20c]

enfin c'était une question mais peut être que personne ne sait ...