Problème de ligation??

[invite2769cbb0]

bonjour,

j'ai cloné un fragment de ma protéine dans un pcDNA3-V5-His TOPO (3.0), cependant je n'ai pas d'expression de ma protéine, en sachant que la ligation a été faite et le sequencage aussi et c'est niquel
je vais donc essayé de le passer sur un autre vecteur (pstar) j'ai donc bien un site bamH1 et EcoR1 sur le plasmide de meme pour mon insert donc ca devrait bien se liger (ligase TAKARA), je pense avoir bien fait ma trasformation mais je n'ai pas de colonies sur mon LB, je ne comprends pas pourquoi
merci d'avance pour votre aide
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[LXR]

Bonjour,

es-tu sûr que ta transformation s'est bien faite? Qu'as-tu utilisé comme contrôle (contrôle d'activité de la ligase, contrôle de clivage effectif par les deux enzymes, contrôle de transformation)?

Greg

[invite2769cbb0]

bonsoir,

merci pour votre réponse LXR
J'ai d'une part fait une ligation avec mon plasmide(digéré), l'enzyme et sans mon insert et d'autre part le plamide,l'insert et l'enzyme je n'ai donc pas de contrôle plasmide liguer par contre je ne pense pas que se soit forcement la transformation vu que d'habitude je n'ai pas de problemes mais j'ai tout de même un petit doute sur la ligation avec la TAKARA qui préconise 5min à 25°C ou 30min à 16°C j'ai donc essayé les deux methodes et j'ai même prolongé à 2h30 à 16°C donc est ce que quelqu'un a déjà eu un soucis avec cette enzymz car les temps de ligation me semblent courts...sinon je ne vois pas
merci d'avance

[LXR]

Le mieux (cela n'engage que moi) dans ce genre de cas c'est de commencer à chercher le problème dès les premières étapes. En effet, s'il est précoce, toutes les étapes qui suivent ne serviront à rien : perte de temps et d'argent.

A ta place je réaliserais déjà un clivage séparé du vecteur avec BamH1 et EcoR1, tu fais migrer sur agarose le plasmide non clivé, le plasmide + BamH1, le plasmide + EcoR1. Là tu vois si ton vecteur est bien clivé par les deux enzymes de restriction.

Ensuite tu clives le vecteur avec BamH1 (ou EcoR1), et tu réalises ta ligation, sans l'insert, puis tu transformes avec le vecteur vide (qui n'a subit aucune étape de modification) et en parallèle avec le vecteur religué. Là tu verras d'une part si la transformation marche (avec vecteur vide) et si la ligase marche (vecteur clivé religué).

Ce que tu peux ensuite contrôler si tout ceci a fonctionné, c'est si EcoR1 clive bien le vecteur après l'action de BamH1 (ou l'inverse) : clivage vecteur avec BamH1 puis ecoR1 (ou l'inverse) et ligation puis transformation. Normalement tu n'auras aucune colonie, mais je te conseille de faire un témoin "clivage BamH1 + ligation + transformation", car le second clivage n'est pas forcément fiable à 100%, donc la présence de quelques colonies ne veut pas dire qu'EcoR1 derrière BamH1 est totalement inefficace.

Pour la vérification du clivage des inserts, il n'y a pas vraiment de méthode rapide de vérification si ce n'est la réussite du clonage lui-même. Si les parties flanquant les sites de restriction utilisés sur l'insert sont suffisamment longues, en migration électrophorétique tu verras une bande spécifique du clivage apparaitre, c'est à ma connaissance le seul moyen de vérifier si cette étape marche.

Tiens nous au courant.

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite2769cbb0]

merci pour tous ces conseils je vais vérifier cela

[LXR]

Je viens de repenser à un de mes sous-clonages qui avait eu du mal à marcher. J'étais arrivé à savoir que mes inserts était bien clivés, de part et d'autres par la même enzyme de restriction car après clivage et ligation, sur mon gel d'agarose j'avais un profil en échelle : une bande à 800 pb (insert), à 1600 (dimère d'insert), 2400 pb (trimère),...Cela montre que l'insert se ligue à lui-même grâce au fait qu'il soit clivé par la même enzyme de restriction à chacune de ses extrémités. Pour un clonage orienté, je doute que cette vérification soit aussi évidente...

Greg