Analyse de prélèvement de surface

[izkira]

Bonjour,

Je suis responsable d'une unité de production de mayo et nous avons eu un retour de produit avec des sortes de moisissures sur l'opercule de scellage du pot. Je dois confirmer que c'est bien des champignons et également voir s'il y a d'autres souches présentes sur l'opercule (entérobact, staph, salmonella).

Après avoir fait un prélèvement avec une anse bouclée, comment ensemencer les boîtes ? Faut-il étaler directement sur la gélose ou bien préparer une solution mère avec très peu de solvant ?

Je n'ai jamais fait ça et ne trouve pas de protocole sur le web.
Nous avons ici tout le matériel pour le dénombrement classique des souches citées, mais pas d'info sur l'identification.

Merci d'avance !
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[LXR]

Bonjour,

Cela n'est que mon avis, mais il me semble raisonnable de :

- Conserver la zone contaminée à 4°C pour des analyses ultérieures.
- Prélever avec une anse la zone contaminée et ensemencer la gélose : une gélose sélectionnant les champignons (+ ampicilline par exemple), une sélectionnant les bactéries (+ fongicides, je n'en connais pas; il y a la néomycine ou G418 qui tue les eucaryotes, donc les champignons mais il y a peut-être plus adapté).
- S'il y a trop de germes, envisager de faire une dilution dans du tampon physiologique.

Cela devrait déjà permettre de débuter les analyses.

Greg

[izkira]

Bonjour Greg,

Tout ce que tu dis correspond justement à ce que je planifie mais la question est : comment fait-on un ensemencement direct ?
C'est juste que je ne m'en souviens plus... on étale directement en stries avec la anse bouclée ? Même ça je ne sais plus comment ça marche... Il faut déposer un peu de moisissure d'abord dans un coin ? Ou bien faut-il forcément une solution ?
Si c'est le cas, comment préparer une dilution à partir de moisissures ? dans combien de peptone sel ? 5 ml ? 10 ml ?

(pour les géloses sélectives, on a déjà tout ce qu'il faut ici, ça c'est bon)

[izkira]

Puisqu'on est dans la microbio, j'en profite pour placer une autre petite question...
Comment les champignons réagissent-ils à la coloration de Gram puisque leur paroi cellulaire est principalement composée de chitine ?
Violet ou rose ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[LXR]

Tu prélève un bout de moisissure, tu le solubilise dans du tampon physiologique, tu homogénéises, puis tu trempes ton anse dans la solution et sur ta boîte de gélose, tu fais des stries. Tout simplement.

Tu peux aussi déposer une goutte sur ta gélose (20-50 µl par exemple), tu déposes des billes stériles, et su agites la boîte avec les billes, puis tu les enlève. Dans les deux cas, tu met à l'incubateur 37°C et c'est bon.

La coloration de Gram ne s'utilises pas sur les champignons, la classification Gram+/- n'étant applicable qu'aux bactéries.

Greg

[izkira]

Merci Greg

Si avec tout ça, j'y arrive pas quand même !!
Je connaissais pas la technique des billes, c'est à tester.

A propos de la coloration, je posais la question car on l'a fait sur l'espèce de moisissure et on observe des sortes de filaments roses et des grosses cellules violettes qui ressemblent fortement à des levures. Je me demandais donc si les filaments observés étaient bien les moisissures ou alors autre chose....

[invite64fbe576]

Pour l'ensemencement des boites, utilise un ensemencement en quadrant. Ta lecture sera plus aisée.
Utilise plutot une pipette pasteur pour te faciliter la tache et ne pas labourer la gélose.
isolement en quadrant

Pour la coloration, ils apparaissent gram +. Mais ils se décolorent très facilement.

[aulie]

Salut,

D'abord si j'étais toi j'enverais simplement les échantillons dans un laboratoire prestataire de service qui a toutes les connaissances et les techniques pour identifier tous ça.

Sinon, pour analyser de la mayonnaise il faut d'abord faire une suspension mère. Pour cela tu prends 10g de ton produit prélevé stérilement et précisement dans un sac pour stomacker et tu ajoutes 90 mL d'eau Phi (ou Eau peptoné je ne sais plus trop.)
Tu passes au stomacker (machine qui permet d'homogéniser les produits solide dans un diluant)

Avec ta suspension mère tu peux préparer un gamme de dilution, avec la technique des dilutions succécive. (1 mL de la suspension mère dans 9 mL de la 10-1 ; 1 mL de la 10-1 dans 9 mL du tube 10-2 ....)

Et ensuite tu encemences tes boites pour chaque dilution que tu auras faites, afin de pouvoir quantifié et bien dissocié chaque colonie.
Tu mets 0,1 mL de ta dilution sur une boîte et tu étales grâce à un étaleur ou rateau (mieux que les billes, car avec les billes tu auras des colonies sur les bords se qui ne facilite pas la lecture)

La quantification se fait avec 3 boîtes. Donc encemence bien 3 boîtes si tu veux quantifier ta contamination.

Pour les moisissures je te conseil la gélose Sabouraud. Elle est sélective des levures/moisissure que tu incuberas à 25°C (température d'incubation des levures/moisissure).

Pour les enterobactéries tu peux faire une gélose Drigalski, elle sélectionne les bacilles gram - à 37°C (dont les entérobactérie, mais attention d'autre bactérie aussi. Il n'y a aucune gélose qui sélectionne que les entérobactéries. Tu peux mettre en évidence la présence/absence de coliformes avec des bouillon BLBVB. (Bouillon lactosé, billié au vert brillant), ou E.coli avec un milieu TBX à 44°C. C'est ce qui est en général demander en agro : coliforme et/ou E.coli)

Pour les staph, tu fais du Chapman. 37°C

Et enfin pour les Salmonelle, une gélose SS (Salmonella Shigella). 37°C

Mais tous ça ne respectera pas vraiment les normes en agroalimentaire. Ca ne sera que indication et ça n'aura aucune valeur pour le service qualité. C'est vraiment mieux si tu fais appelle à un labo prestataire qui feras les analyses selon les normes en vigueur.

[izkira]

Merci Campilo
Concernant la couleur des moisissures, je suis surprise car les filaments observés étaient bien roses....

Aulie, merci pour tes explications, mais on fait déjà tout ça
Le problème dont je parlais était de faire un prélèvement de moisissure sur un opercule qui n'avait pas de mayonnaise (en tout cas pas les 10g nécessaires à la solution mère). Mais problème résolu, tout va bien !!
Par contre, pourquoi dis-tu que les protocoles dont tu parles ne respectent pas les normes ? Je pensais que ces méthodes de dénombrement correspondaient justement à ce que recommande AFNOR...

[aulie]

Oui, j'ai réalisé après que tu voulais un prélèvement de l'opercule, mais la limite d'édition était passé.

Je pense que ça ne correspond pas au norme, parce que je les ai pas sous les yeux et que donc dans ce que j'ai dit il doit y avoir des erreurs, comme les milieux utilisé. Ce que j'ai dit sont des souvenirs de mes cours et en cours on travaillait plus sur de la viande donc peut être pas adapté à la mayonnaise.

Sinon pour coloré les moisissure en général on fait une simple coloration au bleu de methylène : 1 goute sur une lame, prélèvement d'un peu de moisissure grâce à la technique du drapeau (tu prends le fils droit auquel tu mets du scotch, tu poses délicatement le scotch sur la moisissure. Tu colles ensuite le scotch sur la lame, là où il y a la goutte de bleu) et tu observes ensuite à x400.

Le gram est inutil dans ce cas là, vue que le gram sert à différencier les deux types de paroi des bactéries.

Sinon, tu as donc fait comment ?

[izkira]

Bonjour !

Je reviens quelques jours après pour mon dossier mayonnaise avec d'autres interrogations...
Après culture de confirmation, nous avons bien eu des moisissures. Ce cas s'est présenté dans plusieurs lots et nous cherchons maintenant l'origine du problème.
Le point commun à tous les cas de développement de moisissure est que la bobine de l'opercule d'aluminium a été mise à l'envers.
J'explique : l'opercule est composée d'une couche d'aluminium censée être à l'extérieur et une couche plastique censée être à l'intérieur et donc en contact avec le produit.
Si on part du principe que la contamination a eu lieu lors de l'embobinage de la bobine par la société fabricante (oui, ils ne sont pas super réglos...), les germes devraient se trouver sur les 2 faces (puisque dans une bobine il y a contact entre les 2 côtés), pourtant on observe les moisissures seulement quand le côté alu est en contact avec le produit.
Le contact avec l'aluminium pourrait-il favoriser le développement des moisissures ?

Merci d'avance pour vos réponses !!