animal transgénique homozygote

[jeremims]

Bonjour

Je suis toujours sur mon histoire de porc transgénique

Dites moi si je me trompe svp :
Pour avoir un animal réellement transgénique il faut tout d'abord insérer le gène d'interet dans le génome d'une cellule ES, injecter la cellule dans un embryon, il faut qu'elle s'implante dans les gonades de l'embryon, puis il faut faire des croisements pour obtenir un animal homozygote pour le gène.

Comment voir si la cellule est bien dans les gonades ?
Comment etre sûr qu'un animal est homozygote pour le gène ?

merci d'avance pour vos réponses

[Vinc]

Salut!
Ca me parait un peu compliqué!
Tu peux peut -être plutôt modifier directement ton "embryon" au stade cellule unique, ce qui permet d'avoir le transgène dans toutes les cellules!
Enfin c'est ce qu'il me semble.....

[aquilegia]

Tu peux peut -être plutôt modifier directement ton "embryon" au stade cellule unique, ce qui permet d'avoir le transgène dans toutes les cellules!
Enfin c'est ce qu'il me semble.....

En effet, c'est ce qu'il me semble aussi...
Ensuite, pour vérifier si l'animal est homozygote, si tu connais la séquence du gène, il suffit de faire une PCR et une électrophorèse... à partir d'un bout de peau, ou de qq poils...

[jeremims]

Le protocole que je décrit m'a été donné par mes profs de fac. J'avoue que c'est un peu compliqué et pas facile à mettre en oeuvre. Mais je dois passer par des cellules souches, c'est ce qui m'a été imposé

donc il me reste toujours le probleme de localiser mes cellules transgéniques dans mon animal chimère...
SVP AIDEZ MOI

[aquilegia]

Le protocole que je décrit m'a été donné par mes profs de fac. J'avoue que c'est un peu compliqué et pas facile à mettre en oeuvre. Mais je dois passer par des cellules souches, c'est ce qui m'a été imposé

donc il me reste toujours le probleme de localiser mes cellules transgéniques dans mon animal chimère...
SVP AIDEZ MOI

Je vois une solution : faire un transgène en deux parties : le gène que tu veux introduire, plus un gène produisant un marqueur fluorescent : (green fluorescent protein GFP).
Les cellules où le transgène sera inséré produiront dont ctte protéine : elles seront fluorescentes.
Sinon, il doit exister d'autres marqueurs....

[jeremims]

et comment faire pour détecter cette protéine fluorescente?

[aquilegia]

rebonjour
je crois que ça fluoresce tout seul... comme chez la méduse d'où elle a été extraite... ou alors sous UV, peut-etre...
voici un site qui m'a l'air bien documenté:
http://www.biozone-science.net/
(tu trouveras la doc sur la GFP en cliquant sur son nom à gauche, et des photos sous UV et lumière visible)
sinon, sur ce site, tu trouveras d'autres couleurs, si le vert ne te plait pas... http://www.clontech.com/clontech/gfp/index.shtml

[Vinc]

Salut!
Oui la GFP est détectable sous les UV mais je ne suis pas sûr que ca résolve le problème : les cellules concernées seront les cellules des gonades je crois! Alors comment veux tu observer une fluorescence "à 'lintérieur de l'animal" sans le tuer???

[nayeki]

Salut!
Ca me parait un peu compliqué!
Tu peux peut -être plutôt modifier directement ton "embryon" au stade cellule unique, ce qui permet d'avoir le transgène dans toutes les cellules!
Enfin c'est ce qu'il me semble.....

c'est techniquement impossible
Pour effectuer la transgénèse tu as besoin de cellules qui se divisent, donc on utilise des cellules ES, on screen plusieurs centaines de clone (par PCR) et l'on injecte l'embryon.

[jeremims]

sinon, sur ce site, tu trouveras d'autres couleurs, si le vert ne te plait pas... http://www.clontech.com/clontech/gfp/index.shtml

LOL

merci beaucoup à tous