RT-PCR spécifique

[soulseed]

Bonjour,

J'aurais besoin de faire une retro-transcription qui soit spécifique à un mRNA (pour une RT-PCR). J'ai appris que pour synthétiser le cDNA on utilise en général des primers "randoms hexamers" ou des oligo d(T). Cependant, j'aimerais avoir un primer plus spécifique qui retrotranscrira un seul mRNA bien précis. Ce que je voudrais faire: un primer moitié poly d(T) et moitié spécifique à mon mRNA. Mon problème: comment designer ce primer? Les règles sont-elles les mêmes que pour un primer habituel?

Merci d'avance!

[soulseed]

J'ai pensé à quelque chose entre temps: pourquoi ne pas utiliser le même primer qu'un de ceux de la PCR pour la phase de retro-transcription? C'est dû à la température de fonctionnement de la retrotranscriptase?

[stonekiller]

Tu peux toujours utiliser les même primer que la PCR classique mais vérifie s'ils sont dessinés sur la phase codante. Autre chose je ne crois pas qu'il existe de "primer moitié poly d(T) " car justement ces primer amplifie tout les ARNm.

[soulseed]

Merci,

oui entre temps j'ai remarqué que les kits commerciaux one-step qRT-PCR se basent sur le principe d'utiliser les mêmes primers pour la retro-transcription et pour l'amplification, donc ça doit marcher. Par contre, je devine ça doit être moins spécifique vu que la retrotranscriptase fonctionne entre 40-50°C selon le type.