travaux pratiques, isolation plasmide

[invitec8d9247b]

Salut, tous le monde, premierement je dois me presenter, je suis etudiante au Pays-Bas je fais biologie et laboratoire recherches-Bachelor-. je suis d origine algerienne, mariee et mere dun enfant. hier jai fais mon premier TP et cetait un peu sombre pour moi. mes questions sont les suivantes
-le protocol cetait Miniprep plasmide DNA isolation on utilisant alkalique extraction methode.
alors pourquoi on a utilise l ethanol 96% et puis 70% quelle la difference entre eux et quel est le rol dethanol? et pourqoi pas 70% puis ^96%?
apres laddition du RNAase vous devez incuber a 37 degres pourqoi?
on utilise une enzyme de restriction Pst I 1ul et 0,75 ug DNA est ce que la quantite denzyme sufisante pour couper DNA?si non combien t a besoin pour couper cette quantite de DNA?et pour combien de temps?

jai vraiment besoin daide cest ma premiere semaine au college et je suis completement perturbe surtout en ce qui concerne la langue.
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[Zellus]

Bonsoir,

alors pourquoi on a utilise l ethanol 96% et puis 70% quelle la difference entre eux et quel est le rol dethanol? et pourqoi pas 70% puis ^96%?

L'éthanol 70% permet de faire précipiter l'ADN. On utilise d'abord de l'éthanol 96% (ou plus concentré) car on le rajoute en général à un volume de solution aqueuse qui contient l'ADN (souvent après une étape de phénol-chloroforme) et qui va diluer un peu l'éthanol. On rajoute un volume suffisant d'éthanol concentré pour obtenir une concentration finale à environ 70%. On centrifuge alors pour faire tomber l'ADN au fond du tube, on enlève le surnageant et on mets ensuite de l'éthanol à 70% directement, car il n'y a plus de solution aqueuse pour diluer l'éthanol.
Il n'est donc pas conseillé d'utiliser d'abord l'éthanol 70% puis le 96%.

apres laddition du RNAase vous devez incuber a 37 degres pourqoi?

Parce que la RNase fonctionne mieux à cette température.

on utilise une enzyme de restriction Pst I 1ul et 0,75 ug DNA est ce que la quantite denzyme sufisante pour couper DNA?si non combien t a besoin pour couper cette quantite de DNA?et pour combien de temps?

1 µL d'enzyme ça ne veut pas dire grand chose ... Il faudrait connaître la concentration de PstI et elle est écrite sur le tube normalement. La concentration des enzymes de restriction est souvent de 10 ou 20 (parfois 50) U/µL. U est l'abréviation pour "unité (d'enzyme)" et par définition, une unité permet de digérer 1 µg d'ADN en 1 heure à 37°C et dans un volume final de 50 µL.
Donc je pense que la quantité que vous avez utilisée est largement suffisante (surtout si la digestion a été faite 1h à 37°C).

[invitec8d9247b]

Bonjour,
je vous remerci enormement de votre explication, ca va beaucoup maider.