Etapes de la PCR

[invite2af547e3]

Bonjour à tous!!

Petite question au sujet de la PCR!
Durant la PCR on a toujours 3 étapes répété pendant de nombreux cycles qui correspondent à la dénaturation, l'hybridation et la polymérisation.

Cependant, en dehors de ces cycles dans mon programme PCR il y a des étapes que je ne comprend pas
- il y a tout d'abord avant de commencer ces cycles un cycle qui dure 5min à 95°C.
Peut-on parler de hot start???

et ensuite après ces nombreux cycles il y a
- il y a 3 cycles de 5 minutes à 72°C. Pour permettre à l'enzyme de déterminer la polymérisation??

-il y a 47 cycles à 10°C. Qui je ne vois pas trop à quoi ça sert....

Merci beaucoup pour votre aide!
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[Yoyo]

Cependant, en dehors de ces cycles dans mon programme PCR il y a des étapes que je ne comprend pas
- il y a tout d'abord avant de commencer ces cycles un cycle qui dure 5min à 95°C.
Peut-on parler de hot start???

Le hot start correspond a une dénaturation d'un anticorps fixé a l'enzyme. Donc cette étape sert a cela, mais dans la majorité des cas elle ne sert a rien (quand on utilise une taq classique). d'ailleur en la supprimant ca marche généralement mieux.
Une exception pret est l'ADN riche en GC ou une étape de dénaturation est importante pour séparer les deux brins d'ADN.

et ensuite après ces nombreux cycles il y a
- il y a 3 cycles de 5 minutes à 72°C. Pour permettre à l'enzyme de déterminer la polymérisation??

oui normalement ca sert a ca, mais 3 cycles c'est tres court, généralement c'est entre 20 et 30. La je doute que tu amplifies quoique ce soit.

-il y a 47 cycles à 10°C. Qui je ne vois pas trop à quoi ça sert....

Merci beaucoup pour votre aide!

je n'ai jamais vu un tel cycle, moi non plus je ne vois pas a quoi ca sert.

Ou as tu trouvé ce protocole? que fais tu avec?

YOyo

[invite2af547e3]

C'est dans le cadre d'un TP on a réalisé l'amplification d'un cDNA d'un gène par PCR pour pouvoir ensuite réaliser un clonage à l'aide du vecteur TOPO.
J'ai déjà fait de la PCR auparavant mais la j'avoue ne pas trop comprendre l'intérêt de ces cycles...

[Zellus]

Bonsoir,

Déjà les trois cycles de 5 minutes à 72°C je trouve ça bizarre (après les cycles de dénaturation, hybridation et élongation si j'ai bien compris ?) ... Normalement on fait une seule étape de 10 ou 15 minutes à la fin (donc 1 seul "cycle").
J'ai l'impression en fait que le thermocycleur que vous avez utilisé en TP est un vieux modèle qui ne ferait que des étapes de 5 minutes max. Et donc à la fin vous avez mis plein de "cycles" pour conserver le plus longtemps possible les échantillons à 10°C. Normalement on mets à 10°C (voire 4°C) à la fin de la PCR pendant un temps infini mais peut-être que cette machine ne peut pas le faire ... Tu pourrais nous dire quel modèle de thermocycleur vous utilisez en TP à l'occasion stp ?

[A voir en vidéo sur Futura]