Stabilité substrat d'ADN pour test helicase

[invite55b1b7e9]

Bonjour,

Je fais actuellement des tests d'activité helicase
A cette fin j'utilise des substrats d'ADN 3'tale et 5'tale a l'aide d'oligos de 89nt vs 30nt
Le plus petit brin (30nt) est marqué au gamaP32 et ensuite hybridé au plus long oligo (89nt)
je purifie sur gel et j'elue dans du tampon tris, edta

Lorsque j'ai fais mes premiers tests j'ai observé de l'activité mais mon controle sans proteine
relargue egalement du simple brin
J'ai donc commencé par deposer mes sondes seules sans tampon mais mon controle negatif est toujours positif
J'ai repurifié mes sondes sur gel, c'etait vraiment beau (pas d'ADNsb) J'ai elué à 4C dans du tampon contenant en plus du tris et de l'EDTA, du NACL et du MgCl2 pour essayer de stabiliser mon ADN mais toujours rien

Je ne sais plus trop quoi tester
j'utilise mes sondes a 0,1uM final avec une titration de ma proteine de 250nM à 1uM final
est ce que diminuer la quantite de radioactivite pourrait changer quelque chose ?
Je dilue aussi mes sondes juste avant ds de l'eau (1/2) , peut etre devrais je utiliser plutot mon tampon d'elution ? mais je voudrais pas rajouter trop de Nacl ds mes reaction finale
J'ai lu que je pouvais rajouter du glycerol ds mes reactions et ds mon gel
pensez vous que ca pourrait aider ?

merci d'avance pour votre aide
Ellene
-----

[inviteb94d8e21]

Bonjour :

Une question bête :

Tes conditions de migration ne seraient pas un poil dénaturantes (Gel trop chaud par exemple)?

D'autre part, si tu mets de l'EDTA et du MgCl2 dans le même tampon, il y en a un des deux qui ne sert à rien.

Essaye d'éluer ton substrat en Tris pH8 (10mM), EDTA 0.2mM NaCl 50mM, sans Mg, à température ambiante par diffusion passive (pas par électroélution). Pour ça, tu coupes ta bande d'acrylamide en tout petits bouts (1mm3 environ), tu l'incubes une nuit sur la paillasse sans agitation dans deux volumes du tampon ci dessus et tu contrôles le lendemain qu'au moins 50% de ta radioactivité est passée dans le tampon. C'est ce que je connais de plus soft pour éluer un duplex d'oligos.

[invite55b1b7e9]

Bonjour :

Une question bête :

Tes conditions de migration ne seraient pas un poil dénaturantes (Gel trop chaud par exemple)?

D'autre part, si tu mets de l'EDTA et du MgCl2 dans le même tampon, il y en a un des deux qui ne sert à rien.

Essaye d'éluer ton substrat en Tris pH8 (10mM), EDTA 0.2mM NaCl 50mM, sans Mg, à température ambiante par diffusion passive (pas par électroélution). Pour ça, tu coupes ta bande d'acrylamide en tout petits bouts (1mm3 environ), tu l'incubes une nuit sur la paillasse sans agitation dans deux volumes du tampon ci dessus et tu contrôles le lendemain qu'au moins 50% de ta radioactivité est passée dans le tampon. C'est ce que je connais de plus soft pour éluer un duplex d'oligos.

Pour la migration, Bonne idée je vais voir ca

Pour l'elution,d'habitude on elue dans du TEN (tris, edta, Nacl) c'est ce que j'ai fais au debut et pour la deuxieme fois j'ai augmente la conc en Nacl et rajouté du MgCl2 qui en effet maintenant que tu me le dis peut paraitre idiot mais c'est parcequ'on avait deja observe que celui ci stabilisait des substrats tel que des jonctions de holidays
L'elution s'est faite sur une roue a 4C par duffusion, je pense que c aussi soft non ? je vais peut etre essayer
merci beaucoup
ellene