Extraction, purification et analyse d'ARN (Nanodrop et bioanalyser)

[Gordak]

Bonjour,
je suis un débutant dans le domaine de la biologie (étudiant de 2ème année en science de la vie).
Je suis en train de rédiger un rapport d'un travail pratique. J'ai quelques doutes sur ma compréhension de chaque étape des manipulations et techniques effectuées en laboratoire.

Pour commencer, voilà ce que nous avions à faire (ou qui a été fait à notre place). Les prélévements ont été réaliser chez des souris (C57black6, 1-2months), le but étant d'insérer des plasmides avec le gène de l'amylase2 (de la souris) chez des bactéries...

Blue part done before the lab by us; the black part you have to perform.
Wear gloves, protection glasses and lab coat.
1) Add 1ml ice-cold Trizol per 50mg tissue; keep samples permanently on ice;
Homogenize using a tissue homogenizer (Polytron, small tip, 30sec. pos. 6).
3) Shake vigorously by hand for 1 min and wait 5 min. Spin 15 min at full speed
at 4ºC, transfer clear supernatant into a new tube (1.5ml).
4) Add 200μl Phenol/Chloroform/ Isoamylalcohol per tube, shake vigorously by
hand for 15 sec, wait 3 min.
5) Spin 15 min at full speed at 4ºC. Transfer upper (aqueous) phase to a fresh
tube.
6) Add 500μl Phenol/Chloroform/ Isoamylalcohol to aqueous phase. Vortex, and
spin again15min at 4 ºC. Transfer upper phase to a fresh tube.
7) Repeat 6).
8) To the aqueous phase (250μl) add an equal volume of 70% EtOH, mix well
by pipetting.
9) Load onto RNeasy column.
10) Spin 15 sec at 10’000rpm at room temperature (RT).
11) Wash with 700μl RW1, spin 15 sec at 10’000rpm.
12) Use a new collection tube; wash with 500μl RPE, spin as in 10).
13) Wash a second time with 500μl RPE, spin as 10).
14) Spin 2min, 13’000rpm at RT
15) Elute RNA into a fresh tube with 50ul of water; spin 1 min 13’000rpm, put on
ice.

Je dois maintenant rédiger un rapport, mais je ne suis pas certain de ce que j'y dis. Je vais décortiquer le problème en plusieurs points, il devrait être plus simple d'y répondre par la suite

Trizol:
Que fait exactement cette solution ? D'après ma compréhension, elle est composée de :
1) guanidinium thiocyanate
2) phenol
3) chloroforme
4) d'un alcool assez hydrophile (isopropanol ou Isoamylalcohol dans ce cas)
Y a-t-il un agent responsable de détruire la membrane cellulaire ?
Le guanidinium thiocyanate sert à dénaturer les protéines (genre RNase, afin de ne pas dégrader l'ARN). Le SDS pourrait-il faire pareil ?
Les trois autres produits constituent un environnement constitué de deux phases, dont une aqueuse contenant l'ARN.


Phenol/Chloroform/ Isoamylalcohol:
D'après ma compréhension, cette combinaison sert à rendre plus pure la phase aqueuse, en d'éliminant un maximum d'ADN et protéine s'y trouvant encore. Est-ce tout ou y a-t-il un autre but ?


70% EtOH:
Après l'utilisation de trizol et la purification (point précédent),
nous ajoutons de l'ethanol à 70%, pour faire précipiter l'ARN sans faire précipiter les sels, dont nous voulons nous débarasser. Est-ce correct ?


RNeasy column
Je n'ai pas appris le fonctionnement de cette colonne. Est-ce qu'elle agit comme un filtre en fonction de la grosseur des molécules ou utilise-t-elle d'autres propriétés des molécules pour les trier ? D'après moi, elle enlève les petits ARN, qui ne figurent plus sur le bioanalyser après son utilisation.


Après avoir suivi la marche-à-suivre, nous avons analyser notre échantillon au Nanodrop et au bioanalyser...


Nanodrop:
La technique utilise l'absorbance de l'ARN, l'ADN et autre molécules à certaines longueurs d'onde ciblées... Que puis-je dire là-dessus ? Que pouvez-vous dire sur les ratios 260/280 et 260/230 ? Mon analyse me renseigne sur la concentration (en ARN), l'absorbance à 280 et 260 et les deux ratios. Pour indication, j'ai obtenu les résultats suivants:
260/280: 2.13
260/230: 2.03
Ces rations varient-ils entre de l'ARN pure et de l'ADN pure ?


Bioanalyser:
En bref, , il s'agit d'analyser l'ARN ribosomique afin de s'informer sur lintégrité de l'ARN messager (l'ARNr étant plus fragile que l'ARNm chez les eucaryotes). Savez-vous pourquoi on peut supposer cette hypothèse chez les eucaryotes mais pas chez les procaryotes ? Concernant la dégradation ... quelles en sont les effets (enfin, la dégradation, est-ce l'ARN qui est dégradé par les RNases ou est-ce du à la chaleur, un stress physique ou autre ?)


Voilà, c'est à peu près tout, pour le moment
Merci d'avoir lu tout ça, j'attends impatiamment vos réponses
-----

[Flyingbike]

Trizol:
Que fait exactement cette solution ? D'après ma compréhension, elle est composée de :
1) guanidinium thiocyanate
2) phenol
3) chloroforme
4) d'un alcool assez hydrophile (isopropanol ou Isoamylalcohol dans ce cas)
Y a-t-il un agent responsable de détruire la membrane cellulaire ?
Le guanidinium thiocyanate sert à dénaturer les protéines (genre RNase, afin de ne pas dégrader l'ARN). Le SDS pourrait-il faire pareil ?
Les trois autres produits constituent un environnement constitué de deux phases, dont une aqueuse contenant l'ARN.

Le phénol et le chloroforme sont des solvants qui solubilisent la mb plasmique. Le thiocyanate est en effet un truc qui tue tout (un chaotropique) mais le SDS seul ne suffit pas a ma connaissance à dénaturer les protéines. SInon tu as bien compris le principe

Phenol/Chloroform/ Isoamylalcohol:
D'après ma compréhension, cette combinaison sert à rendre plus pure la phase aqueuse, en d'éliminant un maximum d'ADN et protéine s'y trouvant encore. Est-ce tout ou y a-t-il un autre but ?

LE phénol et le chloroforme permettent de solubiliser ce qui n'est pas hydrosoluble.

70% EtOH:
Après l'utilisation de trizol et la purification (point précédent),
nous ajoutons de l'ethanol à 70%, pour faire précipiter l'ARN sans faire précipiter les sels, dont nous voulons nous débarasser. Est-ce correct ?

En fait l'etoh 70% permet a la fois de garder en grande partie l'ARN sous forme non dissoute, mais aussi de le rincer en enlevant une partie des sels qui restent en partie en solution (les 30% d'eau). C'est pour cela qu'on n'utilise pas de l'ethanol pur.

RNeasy column
Je n'ai pas appris le fonctionnement de cette colonne. Est-ce qu'elle agit comme un filtre en fonction de la grosseur des molécules ou utilise-t-elle d'autres propriétés des molécules pour les trier ? D'après moi, elle enlève les petits ARN, qui ne figurent plus sur le bioanalyser après son utilisation.

C'est une info commerciale, mais en gros elle a une affinité pour les acides nucléiques, avec une préférence pour les plus grands.

Nanodrop:
La technique utilise l'absorbance de l'ARN, l'ADN et autre molécules à certaines longueurs d'onde ciblées... Que puis-je dire là-dessus ? Que pouvez-vous dire sur les ratios 260/280 et 260/230 ? Mon analyse me renseigne sur la concentration (en ARN), l'absorbance à 280 et 260 et les deux ratios. Pour indication, j'ai obtenu les résultats suivants:
260/280: 2.13
260/230: 2.03
Ces rations varient-ils entre de l'ARN pure et de l'ADN pure ?

LEs ratios permettent uniquement de s'assurer de la pureté d'un acide nucléique. En effet l'absorbance a 230 concerne divers composés organiques (phénol par exemple) et celle a 280 les protéines. Un ratio de l'ordre de 2 permet de voir que ton extrait est assez propre et ne contient presque que de l'acide nucléique. Par contre aucun moyen en spectro de différencier l'ADN de l'ARN qui abrsorbent a la meme longueur d'onde (260)

Savez-vous pourquoi on peut supposer cette hypothèse chez les eucaryotes mais pas chez les procaryotes ? Concernant la dégradation ... quelles en sont les effets (enfin, la dégradation, est-ce l'ARN qui est dégradé par les RNases ou est-ce du à la chaleur, un stress physique ou autre ?)

Aucune idée. En revanche, le principal ennemi de l'ARN c'est la RNase, meme si l'ARN s'autolyse avec l'augmentation de la température.

[Gordak]

D'accord, merci pour ces réponses rapides
j'aurai probablement d'autres questions dans quelques jours, je les posterai sous une nouvelle discussion.
Encore merci et bonnes fêtes

[Moumoutte]

Salut,

tiens je te renvoie sur ce fil sur lequel le principe des colonnes RNeasy a été décrit
http://forums.futura-sciences.com/bi...it-qiagen.html

Concernant le bioanalyseur il permet une détection de la qualité des ARN grâce aux ARNr car ceux ci sont ultra majoritaires dans la cellule et qu'il lui est impossible de détecter les ARNm. Donc si t'as deux beaux pics d'ARNr c'est que ton ARN est correct par contre si tu ne retrouve pas ces deux pics c'est que ton ARNr est dégradé et par conséquent ton ARNm aussi. Je ne sais pas si c'est juste de dire que l'ARNr est plus fragile que l'ARNm.
Concernant la dégradation des ARN je rejoins Flyingbike en disant que le principal ennemi des ARN sont bien les RNases que l'on retrouve à peu près partout.

Cordialement

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite44dd9300]

Pour ce qui est de la transcriptase inverse chez les eucaryotes, elle existe en effet. La télomérase par exemple a une activité transcriptase inverse je crois (à vérifier) elle utilise un "template" ARN pour transcrire les séquences des télomères :séquences TTAGGG. De plus, il existe aussi les rétrotransposons qui appartiennent à la grande famille des éléments transposables (wikipedia) qui sont des séquences qui peuvent se dépacer dans le génôme et qui utilise aussi la "transcription inverse".

Emilien t'es un fish!

[Gordak]

Bonjour,
Je viens vous présenter de nouvelles questions, au sujet de manipulations que nous avons faites juste après avoir extrait, purifié et analysé notre ARN (voir premier post).
Maintenant, nous avons du faire une transription inverse de l'ARN purifié, afin de l'insérer dans des plasmides par la suite...

Il y a quelques doutes qui planent sur le protocole suivi (ci-dessous en bleu):

Protocol:
For a well controlled PCR experiment one should perform for each sample a RT+
and a RT- reaction to rule out amplification of genomic DNA sequences. We are
going to make only the RT+ reactions, because of our intron-spanning primer design
and the previous tests we performed.
Primer annealing (Denaturation and hybridization):
Small volumes into larger ones!
Pipette the following into a labeled 200μl PCR tube:
10μl H2O
1μl oligodT12-18 (50μM)
1μl liver RNA (1ug/ul dilution of your liver RNA in H2O)
1μl dNTP (10mM each)
Incubate 65°C for 5min (PCR machine), chill on ice, quick spin
Reverse Transcription:
RNasin requires DTT to present to be active (S-S to SH + SH reduction)!
Enzymes last!
Add: 4μl 5x buffer (Invitrogen)
1μl 0.1M DTT (Invitrogen)
1μl RNasin (40u; Promega)
1μl Superscript III (200u; Invitrogen)
Mix by pipetting gently, avoid creating air bubbles!
Incubate 50°C, 60min; 72°C, 15min; 4°C on hold (PCR machine, program RT)
Store the cDNA at -20°C

Encore une fois, je vais séparer les question que je me pose:

oligodT12-18:
S'agit-il d'une amorce spécifique (se fixe à une séquence d'ARN précise ) ou se fixe-t-elle seulement aux chaines polyA, afin de faire la RT seulement sur les ARNm (comme ça on élimine les ARNr et ARNt).

Primer annealing:
De façon générale, s'agit-il de fixer l'amorce sur les séquences qui subissent la RT ? Dans ce cas...à quoi sert-il d'élever la température à 65 °C ? Parce qu'il semble superflu de dénaturer (on a affaire à des ARN simples brins). Serait-ce une température idéale pour fixer l'amorce sur les séquences cibles ?

Reverse Transcription:
La présence de DTT et de RNasin constitue-t-elle une précaution contre l'éventuelle présence de RNase (car nous avons déjà bien purifié l'ARN) ou y a-t-il une raison supplémentaire ? L'RNasin est-elle bien un inhibiteur des RNase ?


Incubate 50°C, 60min; 72°C, 15min; 4°C on hold (PCR machine, program RT):
En quoi est-il utile de modifier les températures ? La première étape sert-elle à favoriser la RT (60 minutes, on a de quoi être sûr que tout soit bien "RT"?) ? La deuxième étape (72°C) est-elle une phase "d'amplification" de l'ADNc (que se passe-t-il avec les brins hybrides à cette température?)

Finalement:
A la fin de cette procédure, qu'est-ce que la solution contient vraiment ? un double-brin hybride (ADNc et ARN) ou des simples brins d'ADN, mélangés avec tous les autres ARN (messagers, ribosomiques et transfert) ? Selon moi, il reste des brins hybrides...

Merci d'avance et pour votre patience

[Flyingbike]

oligodT12-18:
S'agit-il d'une amorce spécifique (se fixe à une séquence d'ARN précise ) ou se fixe-t-elle seulement aux chaines polyA, afin de faire la RT seulement sur les ARNm (comme ça on élimine les ARNr et ARNt).

C'est simplement un polymére de dTTP, ce qui permet en effet de transcrire uniquement les messagers. La limite de l'utilisation de ces amorces est que on amplifie moins efficacement les 5' des messagers longs.

Primer annealing:
De façon générale, s'agit-il de fixer l'amorce sur les séquences qui subissent la RT ? Dans ce cas...à quoi sert-il d'élever la température à 65 °C ? Parce qu'il semble superflu de dénaturer (on a affaire à des ARN simples brins). Serait-ce une température idéale pour fixer l'amorce sur les séquences cibles ?

Certains ARN sont bourrés de structures secondaires. Cela permet de les enlever. L'étape importante est de placer les ARN directement dans la glace apres l'étape a 65°, car les laisser regagner la température d'élongation (42°) leur permettrait de se renaturer.

Reverse Transcription:
La présence de DTT et de RNasin constitue-t-elle une précaution contre l'éventuelle présence de RNase (car nous avons déjà bien purifié l'ARN) ou y a-t-il une raison supplémentaire ? L'RNasin est-elle bien un inhibiteur des RNase ?

Oui, la RNAsin est un inhibiteur des RNases. Mon avis personnel la dessus : si tu as des RNases il y ades chances pour qu'elles proviennent de l'extraction, c'est pour ca que j'ai arreté d'ajouter des RNases dans la RT. Quand on voit le prix de ce machin !!! (et mes RT fonctionnent aussi bien...)
Le DTT stabilise les acides nucléiques. C'est en effet un réducteur mais je ne pense pas qu'il suffise a tuer les RNases.

Incubate 50°C, 60min; 72°C, 15min; 4°C on hold (PCR machine, program RT):
En quoi est-il utile de modifier les températures ? La première étape sert-elle à favoriser la RT (60 minutes, on a de quoi être sûr que tout soit bien "RT"?) ? La deuxième étape (72°C) est-elle une phase "d'amplification" de l'ADNc (que se passe-t-il avec les brins hybrides à cette température?)

50° est la température de fonctionnement de l'enzyme (je suppose, la mienne marche a 42...) En 60 minutes tu as en principe le temps d'obtenir des ADNc de tous tes messagers.
72° pendant 15 min permet simplement d'inactiver l'enzyme qui perd ainsi toute activité. (tu comprendras qu'il peut etre genant d'avoir encore une activité polymerase (ou meme exonuclease) apres la RT PCR).
4° c'est juste pour conservation, mais il faut savoir que les thermocyclers n'aiment pas trop rester froid pendant trop longtemps. Tu peux laisser a 10° pendant 12h ca tient le coup.

Finalement:
A la fin de cette procédure, qu'est-ce que la solution contient vraiment ? un double-brin hybride (ADNc et ARN) ou des simples brins d'ADN, mélangés avec tous les autres ARN (messagers, ribosomiques et transfert) ? Selon moi, il reste des brins hybrides...

Héhé, bonne question. En principe tu as autant d'ARNm que de cDNA, plus tous les ARN non rétrotranscrits (donc ARNt et r). Perso, lorsque je fais une RT avec des pDN6 (des amorces de 6 nucléotides aléatoires, donc potentiellement non sélectifs du type d'ARN) la quantité d'acides nucléiques double apres la RT.

Bonne fin de journée !

[Gordak]

Merci beaucoup Professeur

Encore une série de questions ... hum
Cette fois, cela concerne la PCR (directement après avoir purifié et RT les ARNm). Durant la PCR, nous avions amplifié seulement des ADNc spécifiques (avec deux amorces, Amy2 et TBP).

Voici une liste du matériel :

Material:
1)Micropipettes and tipsIce and cool rack
2)cDNA (L liver- yours; P pancreas, K kidney, B brain)

3)PCR primers for Amy2 and TBP (3μM)
4)2xPCR master mix (Roche; Tris buffer pH 8; DMSO, Glycerol, Na-azide, dNTP and
dUTP, Taq polymerase)
5)Uracil glycosylase (Roche; 2u/μl))

6)Nuclease-free water
7)10mM Tris-HCl pH 7.5
8)Thermal cycler (Biometra)
9)Ice, cold block
10)Pipetmen, strip of 200ul microtubes, tips, etc.
11)2% E-gel™ 48; E-Base™ electrophoresis device (Invitrogen)


Uracil glycosylase:
Gros gros brouillard autour de cette enzyme. On nous a expliqué qu'elle était utilisée pour "nettoyer" les machines PCR d'ADN encore présent et potentiellement contaminant. En effet, les Uracil glycosylases servent à couper les chaines d'ADN à coté des Uracils. Le grand mystère, c'est comment les uracils se sont retrouvés dans les chaines d'ADN ? Est-ce que la Taq polymerase utilise (peut utiliser) des dUTP pour synthétiser un brin d'ADN ? Parce que durant notre travail, nous avons du ajouter 4), 5) et 6) à notre ADNc...donc la Taq polymerase aurait pu utiliser les dUTP et la Uracil glycosylase couper les brins ainsi synthétisés...ce qui aurait été plutôt facheux.


DMSO, Glycerol, Na-azide:
DMSO est un solvant organique...une raison particulière quant à son utilisation ? Pourquoi ajouter du glycerol (utile à la réaction ??) ? Qu'est-ce que le Na-azide ?


Tris-HCl pH 7.5:
Utilisé pour l'electrophorèse après la PCR. La question...est-ce utilisé pour "charger" l'ADN. L'ADN étant acide, dans une solution basique il aurait tendance à libérer des protons et donc se charger. (pour faire une analogie, il prendrait le rôle du SDS [quelque chose comme ça?] pour l'electrophorèse des protéines ?)

Merci d'être présent et de prendre du temps à répondre à toutes mes questions ! Encore une bonne année à vous tous !

[Flyingbike]

Uracil glycosylase:
Gros gros brouillard autour de cette enzyme. On nous a expliqué qu'elle était utilisée pour "nettoyer" les machines PCR d'ADN encore présent et potentiellement contaminant. En effet, les Uracil glycosylases servent à couper les chaines d'ADN à coté des Uracils. Le grand mystère, c'est comment les uracils se sont retrouvés dans les chaines d'ADN ? Est-ce que la Taq polymerase utilise (peut utiliser) des dUTP pour synthétiser un brin d'ADN ? Parce que durant notre travail, nous avons du ajouter 4), 5) et 6) à notre ADNc...donc la Taq polymerase aurait pu utiliser les dUTP et la Uracil glycosylase couper les brins ainsi synthétisés...ce qui aurait été plutôt facheux.

Franchement je n'ai jamais vraiment compris comment on s'en servait, mais en gros, il s'agit de détruire les brins qui ont incorporé du dUTP. Sur le site de Roche : "A further application is carryover prevention for PCR. During PCR, dUTP can be incorporated into the PCR product. Before a subsequent amplification reaction, contaminating PCR products are degraded using uracil-DNA glycosylase. The enzyme is inactivated at the beginning of the amplification reaction by heating to 95°C. Simultaneous strand cleavage of the U-DNA is achieved during this heating step."

DMSO, Glycerol, Na-azide:
DMSO est un solvant organique...une raison particulière quant à son utilisation ? Pourquoi ajouter du glycerol (utile à la réaction ??) ? Qu'est-ce que le Na-azide ?

Le DMSO est effectivement un solvant, mais il permet aussi de prévenir la formation de structures secondaires dans l'ADN lors de la PCR. Le Na-azide est typiquement un conservateur utilisé dans beaucoup de produits de biologie (tampons, enzymes, anticorps...).

Tris-HCl pH 7.5:
Utilisé pour l'electrophorèse après la PCR. La question...est-ce utilisé pour "charger" l'ADN. L'ADN étant acide, dans une solution basique il aurait tendance à libérer des protons et donc se charger. (pour faire une analogie, il prendrait le rôle du SDS [quelque chose comme ça?] pour l'electrophorèse des protéines ?)

Il n'y a pas besoin de charger de l'ADN. Le tris est un tampon tres souvent utilisé. Je ne sais pas a quel moment tu l'utilises, mais ca peut servir a :
-solubiliser l'ADN qui est plus soluble et plus stable dans une solution tamponée (style Tris-EDTA) que dans l'eau
-entrer dans la composition du tampon de chargement (tris, bleu(s), glycerol ou sucrose, eventuellement EDTA)
-entrer dans la composition du tampon d'electrophorèse et du gel (le "tris borate EDTA" ou "tris acetate EDTA")

[Gordak]

Hmm, d'accord.
Il y a quand même un point qui reste obscur. En ce qui concerne l'utilisation de dUTP. Comme nous allons insérer l'ADN amplifié dans des plasmides afin de les introduire dans des bactéries, le fait d'utiliser des dUTP lors de la PCR pose-t-il un problème ?
Car il nous est demandé:
Is it possible to clone a dU containig amplicon in a plasmid in E.coli? What is the problem and how can you solve it?

A partir de ça, est-ce qu'il y aurait un moyen efficace de "changer" les bases U(désoxyribonucléotide) en T ?

[Flyingbike]

Pour ca je ne crois pas pouvoir t'aider. Même si je fais beaucoup de BM je n'ai jamais utilisé ce système.

[Gordak]

Bonjour, j'ai une question concernant les PCR.
Voilà, je me demandais si on utilisait des amorces ADN ? Dans le cas où on utilisait des amorces ARN, il faudrait les dégrader et les substituer par de l'ADN? La Taq pourrait-elle faire cela ?
je m'étais jusqu'à maintenant toujours dit que les amorces étaient de l'ADN, mais maintenant que le dout s'est emparé de moi ... j'ai pensé à vous

Merci d'avance pour vos réponses, qui m'ont beaucoup aidé durant mon travail

[Flyingbike]

Pour les PCR classiques on utilise toujours des amorces ADN. C'est plus facile a synthétiser et a manipuler. In vivo pour la réplication il y a synthese d'amorces ARN par la primase qui sont ensuite remplacées par de l'ADN mais en PCR il n'y a pas de raison.