Tampon SDS-PAGE

[ozzypo]

Bonjour, j'aimerais savoir l'utilité du SDS dans le tampon. le sodium dodecyl sulfate (SDS) est un détergeant fort qui enveloppe les chaînes polypeptidiques des protéines de charges négatives. Ces charges se repoussent et déplient les chaînes polypeptidiques.
Donc, les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native.
les protéines n'ont plus de pont disulfure : elles sont sous une forme monomérique.

Si je comprend bien le le tampon SDS est juste utilisé pour les Western Blot ? Il y a t'il autre utilité pour le SDS ?
Merci
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[Flyingbike]

le SDS dans un WB permet aux protéines d'avoir une charge proportionnelle a leur masse et donc de les faire migrer selon leur poids moléculaire indépendamment de leur structure. Le SDS a d'autres utilités, on le trouve dans certains tampons de lyse ou il a un role de détergent des membranes.

[ozzypo]

J'ai une autre question à propes des tampon pour les WB. Si je prépare mon tampon avec du méthanol, au lieu du SDS. Le méthanol à t'il même utilité que le SDS? Permet-il aux protéines d'avoir une charge proportionnelle à leur masse?
Merci

[nowell]

Le sds est également un chaotropique détergent. Il peut etre utilisé pour détruire les membranes biologiques, et couper les pont S-S de la config 3D protéique.
Il n'est donc pas qu'utile en WB

[A voir en vidéo sur Futura]

[Zellus]

Bonjour,

les protéines n'ont plus de pont disulfure : elles sont sous une forme monomérique.

et couper les pont S-S de la config 3D protéique

Attention ! Ce n'est pas le SDS qui coupe les ponts disulfures lorsqu'on fait un gel dénaturant, mais un réducteur comme le bêta-mercaptoéthanol.

Si je comprend bien le le tampon SDS est juste utilisé pour les Western Blot ? Il y a t'il autre utilité pour le SDS ?

On l'utilise tout simplement pour faire des gels dénaturants, sans forcément faire un WB après.
On peut aussi l'utiliser pour tester la résistance de certains complexes protéiques. Par exemple, certaines fibres formées par l'assemblage de protéines sont résistantes à des concentrations qui dénaturent la protéine monomérique.

J'ai une autre question à propes des tampon pour les WB. Si je prépare mon tampon avec du méthanol, au lieu du SDS. Le méthanol à t'il même utilité que le SDS? Permet-il aux protéines d'avoir une charge proportionnelle à leur masse?

Non car le méthanol n'est pas chargé.

[nowell]

Au temps pour moi, c'est vrai le SDS ne coupe pas les S-S, mais est associé au béta ME et autres composés.

[ozzypo]

Si le méthanol n'agit pas comme le SDS quel est donc son utilité? Merci

[LXR]

Son utilité est de dissocier le SDS de la protéine afin que celle-ci puisse interagir avec la nitrocellulose ou le PVDF, et y rester fixée. Pour cette raison, il est important que le pH du tampon de transfert soit entre 8 et 8,5 pour que la protéine migre bien vers la membrane puisque sans SDS elle migre selon ses propres charges et non plus celles du SDS qui l'entouraient. Donc les notions de pI de la protéine réapparaissent.

Greg

[inviteee9cffed]

Bonjour,
Juste une petite question, est il possible que sur un western blot, si le tampon de charge est un peu vieux (donc que je n'est pas rajouté de B-mercapto avant de l'utiliser mais qu'il sent encore bien fort) il y ai des pont S-S qui aient résisté.
Plus généralement, meme avec la bonne concentration de B-mercapto, y a t-il des pont S-S qui peuvent résister, et pour finir quel est le meilleur moyen de dénaturer à mort des prot pour un blot, SDS, chaleur, B-mercapto.... Et?

Merci pour vos réponse.

[Flyingbike]

Salut mec
Tu peux deja commencer par utiliser des produits frais, sinon il y a le DTT mais je crois qu'il a du mal avec les ponts disulfures enfouis.
Tu peux augmenter le temps de dénaturation (ex 10 min a 100°)

[inviteee9cffed]

Salut gros, Comment va?
Sinon je voulais savoir simplement si c'est possible que des ponts S-S résistent... Est ce tout simplement possible, ou le beta-mercapto est tellement puissant que mm une qté faible peut avoir une action trés importante.

merci

[Flyingbike]

Ca roule et toi ?
ben faut forcément qu'il y ait un ratio molaire suffisant entre le nombre de S-S et de ß mercapto, mais je pense qu'il est de toute façon en excès. Si ton ß mercapto est deja tout réduit, ca va forcément moins bien marcher.
Je pense qu'un pont SS fortement enfoui peut résister meme au beta, c'est pour ca qu'il faut essayer d'augmenter le temps de dénaturation et/ou la température.

[inviteee9cffed]

Bon de tout façon je compte refaire du tampon et optimiser la dénaturation, en espérant que j'obtienne ce que je veux... Mais bon ça serait trop facile que ça marche comme ça!
Sinon tout baigne pour moi...
Il faut qu'on se fasse un truc un de ces jours?