Comment, après transgenèse à l'aide d'un adénovirus, le gène épisomal, non réplicatif est répliqué ?

[invitecd88d92a]

Bonjour je fais un tpe sur le thérapie génique et j'aimerai savoir comment le géne épisomal est répliqué, exprimé et quels sont ces interférences avec les autres gènes (dans le cas des cônes) ?
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[fabien.che]

Le transgène apporté par un adénovirus n'est pas répliqué. L'information génétique est donc diluée au fur et à mesure des divisions cellulaires. C'est un inconvénient majeur de l'utilisation des adénovirus en thérapie génique.

Pour ce qui est de son expression, ce sont les protéines nucléaires de l'hôte qui s'en chargent.

Enfin, il n'y a, a priori, pas d'interférences avec les autres gènes.

(Je n'ai pas compris ton histoire de cônes...)

[invitecd88d92a]

Merci Fabien pour cette réponse. Nous faisons un TPE sur la guerison du daltonisme. En effet des chercheurs ont réussit a l aide de la thérapie génique de soigner des singes écureuil qui n arrivaient pas a distinguer le rouge et le vert. Je ne sais pas si tu as quelques connaissances dans ce domaine mais il existe trois types de cônes spécialisés dans une bande lumineuse speciale le rouge le vert et le bleu a l aide des opsines. Les singes ne possédant pas l opsine rouge et par conséquent le cônes rouges ne peuvent distinguer le rouge et le vert. Mais les chercheurs lui ont rendu la vision de ces couleurs en lui injectant au niveau des cônes le gêne codant pour l opsine rouge. Au bout de quelques mois il était capable de distinguer le rouge. Seulement voilà on se pose la question comment ces gènes se sont exprimés entrant ainsi en conflit avec les autres gènes (bleu et vert). Et puis comment le taux de cône rouge s est stabilise pour permettre cette vision multispectrale ?

[fabien.che]

Aaaaah les cônes ! Je pensais que tu parlais de gènes... autant pour moi. C'est un sujet très intéressant. Mais, je ne suis pas un spécialiste de l'oeil, aussi, nous allons réfléchir ensemble...

Trois types cellulaires différents (trois types de cônes) permettant de distinguer 3 couleurs. Un défaut dans le daltonisme : la perception du rouge.

Est-ce un défect cellulaire (absence des cônes permettant la perception du rouge) ou un défect protéique (présence des cônes mais mutation du gène codant pour l'opsine "rouge") ?

Si c'était un défect cellulaire, cela me poserait un problème car dans ce cas, les chercheurs auraient transfecté les cônes présents. Donc, il y aurait expression du transgène dans les cônes spécialisés dans la vision du vert et du bleu, donc plus de discrimination des couleurs ? (co-expression vert/rouge et bleu/rouge).

Dans le cas d'une mutation génique, comment ont-ils pu cibler précisément les cônes impliqués dans la vision du rouge ? Le tropisme des adénovirus n'est pas aussi sélectif !

J'apporte plus de questions que de réponses, désolé pour ma curiosité...

Pourrait-on avoir des références relatives aux travaux que tu décris ?

Sinon, en restant dans le domaine de la thérapie génique et de l'optique, des chercheurs ont réussi à guérir des hommes d'une pathologie de l'oeil également : l'amaurose de Leber. Ça peut faire une ouverture sympa pour votre TPE...

[A voir en vidéo sur Futura]

[franckeeuuhh]

le problème de l'adénovirus c'est qu'il transfecte un ADN épisomale donc qui ne s'intègre pas forcément au génome de la cellule à modifier. Ce qui fait que ce gène peut être perdu à travers les divisions successives.
On utilise les adénovirus pour transfecter sur des cellules à très faible taux de division comme ça elles ne perdent pas facilement le gène que l'on souhaitait intégrer (sinon tu utilises un rétrovirus qui intègre l'information portée par l'ARN du virus après rétrotranscription pendant un "travail" de l'ADN de la cellule à transfecter).
Il se peut maintenant que l'ADN injecté par l'adénovirus soit intégré lors d'une réparation de l'ADN ou encore la duplication et qu'il intégre la nouvelle information. Le problème c'est que l'on ne peut pas guider l'ADN viral quelque part dans l'ADN génomique donc il peut s'intégrer en plein milieu d'un gène de ménage et là problème ....
S'il s'intègre dans une zone poubelle ... nikel

je ne sais pas si j'ai bien compris ton problème mais n'hésite pas, je ne suis pas un grand spécialiste des yeux mais la génétique moléculaire et les modifications génétiques oui

[invitecd88d92a]

Il y a plusieurs points obscurs à éclaircir, mais commençons par le début.

Ils existe trois types de photorécepteurs à la sensibilité spectrale différentes : Les cônes. Cette sensibilité est définie par les opsines. Dans les cônes bleu il y a de l'opsine S, dans les cônes vert de l'opsine M, et dans les cônes rouges de l'opsine L.
Les singes écureuil ne possèdent pas cette opsine L et par conséquent n'ont pas de cônes rouges et ne distinguent pas le rouge du vert.

Les chercheurs ont injecté dans la rétine un adénovirus contenant le gène codant pour l'opsine L (rouge). L'adénovirus est bien choisi car il pénètre mieux dans les neurones.

1 Question : Comment l'adénovirus est ciblé à ces cônes ?

De plus les adénovirus sont capable d'agir dans les cellules qui ne se divisent pas.
Les cônes étant des photorécepteurs contenant une partie synaptique, je doute qu'ils subissent la mitose. Ce sont donc des cellules "neuronales". De plus ces cellules sont spécialisés dans une bande lumineuse.

2 Question: Comment ce gène (rouge) est exprimé ? et pourquoi n'entre t il pas en conflit avec les autres gènes (vert et bleu) ?

En effet si le gène codant pour l'opsine L (rouge) est exprimé dans un cône vert cela altère radicalement la vision.

De plus les singes écureuil n'ont pas de cône rouge c'est une caractéristique de l'espèce. Comme les daltonien du rouge il possèdent uniquement des cônes vert et bleus. En effet ont remarque qu'en l'absence de gène "rouge" l'organisme ne produit pas de cellules "inutiles", (cônes rouges mais sans opsine) mais s'adapte et remplace ces cônes par des cônes vert (ou bleu)

3 Question : Comment une nouvelle forme de cône (rouge) peut apparaitre dans un organisme qui n'en fabrique pas.

Il ne faut pas oublier que ce sont des "neurones". Il peut donc y avoir une plasticité du tissu neuronal, qui permet ce développement cellulaire à l'aide de circuits pré-existant.

4 Question :Mais est ce que cette plasticité explique la non prolifération de cône rouge? En effet pourquoi alors il y a un taux à peu près équivalent de cône rouge et vert ( les bleus étant sensiblement moins nombreux) ?


En ce qui concerne les études des chercheurs il n'y a pas grand chose ("Jay Neitz Lab" sur Google) De plus c'est en anglais.

Merci d'avance pour l'attention que vous portez à mes questions.

PS; L'ouverture de notre TPE traite effectivement de l'amaurose de Leber

[fabien.che]

Bon, j'ai trouvé l'article publié récemment dans Nature.

Gene therapy for red-green colour blindness in adult primates.
Mancuso K, Hauswirth WW, Li Q, Connor TB, Kuchenbecker JA, Mauck MC, Neitz J, Neitz M.
Nature. 2009 Oct 8;461(7265):784-7

Allons-y :

1 Question : Comment l'adénovirus est ciblé à ces cônes ?

C'est ce que je disais, le tropisme des adénovirus n'est pas suffisamment sélectif pour n'infecter qu'un type cellulaire en particulier. Le virus va donc infecter différents types cellulaires et pas uniquement les cônes.
MAIS, dans l'article ils précisent avoir construit le transgène de telle façon que l'expression du transgène (et non pas sa présence ou son absence) sera contrôlée, entre autre, par un promoteur spécifique des cônes (je cite l'article : "Serotype 2/5 recombinant adeno-associated virus (rAAV) containing a human L-opsin gene under the control of the L/M-opsin enhancer and promoter [...]. Transcriptional regulatory elements were chosen to direct expression preferentially in M cones, but not short- (S) wavelength-sensitive cones or rods.)

2 Question: Comment ce gène (rouge) est exprimé ? et pourquoi n'entre t il pas en conflit avec les autres gènes (vert et bleu) ?

Une partie de la réponse à cette question se trouve ci-dessus (expression enhancer/promoteur-spécifique). Donc pas de soucis pour l'opsine S. Mais effectivement, il y a co-expression des opsines L et M. Dans l'article, l'explication est que cette co-expression va induire une remodelage cellulaire conduisant à la formation d'un nouveau type de cône ("Co-expressing the L-opsin transgene within a subset of endogenous M-cones shifted their spectral sensitivity to respond to long wavelength light, thus producing two distinct cone types absorbing in the middle-to-long wavelengths, as required for trichromacy.")

En effet si le gène codant pour l'opsine L (rouge) est exprimé dans un cône vert cela altère radicalement la vision.

Et bien apparemment pas. Il y a une adaptation de la cellule transfectée (c'est génial, au passage !). La perception du rouge ou du vert dans une de ces cellules dépendra, je pense, de la quantité d'opsine exprimée (si les M sont majeures, la cellule percevra le signal vert, si les L sont majeures, se sera le signal rouge...).

Sur leurs singes il y a restauration de la vision du rouge mais apparemment (j'ai juste survoler l'article) il y a des nuances de gris par exemple, qu'ils n'arrivent toujours pas à distinguer.

3 Question : Comment une nouvelle forme de cône (rouge) peut apparaitre dans un organisme qui n'en fabrique pas.

La réponse à cette question se trouve également ci-avant.

4 Question :Mais est ce que cette plasticité explique la non prolifération de cône rouge? En effet pourquoi alors il y a un taux à peu près équivalent de cône rouge et vert ( les bleus étant sensiblement moins nombreux) ?

C'est une mutation génétique, lors du développement de l'animal l'absence de l'opsine L induit probablement une dégénérescence des cônes rouges, ou bien un remplacement (switch) des cônes rouges par les autres types de cônes.

Edit : En postant ce message je viens de me rendre compte d'une chose. Le vecteur utilisé est un AAV ! Et non pas un adénovirus ! C'est totalement différent. Les AAV sont des virus intégratifs, ils sont donc capables d'intégrer le trasngène au génome de l'hôte !

[invitecd88d92a]

C'est donc un AAV, (il a plusieurs version différentes de l'expérience) De toute façon que le gène soit réplicatif ou non réplicatif cela ne change pas grand chose puisque de toute façon les cônes ne se divisent pas.

Si j'ai bien tout compris voilà comment cela se passe :

-les chercheurs injectent dans la rétine des singes le vecteur AAV contenant le gène de l'opsine rouge

-Ce vecteur infecte les cônes grâce à un promotteur. Le gène choisit s'intègre au matériel génétique des cônes.

-Ce gène sera exprimé dans les cônes verts

-Selon les cônes il y aura plus ou moins d'opsine vert ou rouge ce qui va différencier les cônes. L'opposition vert rouge est possible grâce à la plasticité du tissu neuronale. Malgré elle n'est pas parfaite

-La prolifération des cônes rouges à l'insu des cônes verts est contrôlée par les chercheurs, en contrôlant le virus

[fabien.che]

Ce vecteur infecte les cônes grâce à un promotteur.

Non. L'intégration est un mécanisme liée au virion. Le promoteur est une séquence non codante d'ADN qui permet de favoriser la transcription du gène, donc son expression, indépendamment de son intégration.

Le gène choisit s'intègre au matériel génétique des cônes.

Quand il s'agit d'AAV, oui. Pas pour les adénovirus (si toutefois dans d'autres références on utilisait ce vecteur).

Ce gène sera exprimé dans les cônes verts

Oui. Mais le transgène est également probablement présent dans les cônes bleus. Toutefois, comme l'expression du transgène est dépendante d'un promoteur cellule-spécifique (que l'on ne trouve que dans les cônes rouges et verts), il ne sera pas exprimé dans ces cônes bleus.

Selon les cônes il y aura plus ou moins d'opsine vert ou rouge ce qui va différencier les cônes.

C'est une supposition personnelle. A vérifier.

La prolifération des cônes rouges à l'insu des cônes verts est contrôlée par les chercheurs, en contrôlant le virus

Comme tu l'as dit, les cellules neuronales sont post-mitotiques. Les cellules transfectées ne vont donc pas proliférer. Il s'agit plutôt d'une trans-différenciation. Encore que cette différenciation soit vraiment mineure car il s'agit toujours de cônes.

Et non, c'est un processus incontrôlé. Mais l'efficacité de transfection du transgène n'est pas de 100% (loin de là), donc seule une petite partie des cônes verts transfectés va subir cette trans-différenciation en cônes rouges. Même suite à cela, on arrive certainement pas à la proportion de cônes rouges naturelle. Mais le peu de cellules qui vont "changer" va suffir à rétablir une vision trichromatique, bien qu'imparfaite.

[invitecd88d92a]

Est ce que le fait que le gène soit intégré ou non au matériel génétique de la cellule change l'expression de ce gène et donc la synthèse de la protéine en question ( synthèse plus ou moins importante) ?

De plus, est ce que le promoteur entraine une augmentation significative de "l'expression" de ce gène ?

[fabien.che]

A priori, le statut intégré ou épisomal du transgène n'influence pas son expression, ou alors faiblement. C'est surtout la nature du promoteur qui va déterminer le niveau d'expression (il existe des promoteurs forts, d'autres moins).

Je dirais que sans promoteur, et ceci est valable pour tout gène (ou presque, comme toujours en biologie), l'expression du gène, donc les niveaux d'ARN sont quasi nuls, et les niveaux protéiques en conséquence encore plus faibles. Un promoteur est indispensable à l'expression d'un gène pour avoir un effet physiologique.

[invitecd88d92a]

Merci beaucoup pour ces réponses