gros loading de protéine pour un western blot

[invitef08a311f]

Salut à vous,

J'ai un petit problème avec mon prof de Master (biologie) et je fais un petit SONDAGE...

Mais tout d'abord:
Je travaille avec des Cancers StemCell qui ont un cytoplasme relativement petit (selon mon prof, moi j'en sais rien...)
Je fais pas mal de Western blot et mon prof est convaincu qu'il faut des loadings de 60ug de protéine pour avoir une chance de marquer les quelques protéines (Hif1a, VHL...) qu'ont veut (avec des anticorps pour lesquels nous n'avons toujours pas de ctrl positif, soi-dit en passant).
J'utilise un kit invitrogen pour la migration sur gel et un transfert sur membrane selon la méthode Laemli (transfert par diffusion sur 2 membranes).
Vu que c'est super chiant de loader 60ug dans un puit de 20ul (TRèS souvent mon échantillon n'est pas assez concentré) je me demandais la quantité que les gens avaient l'habitude loader dans leur gel, juste pour savoir... Parce que autour de moi ils ont tous la berlue quand je leur parle de mes 60ug minimum...
Je ne cherche pas à résoudre un problème ou quoi que ce soit de technique... J'essayerai de me débrouiller pour ça.

Dites moi juste si vous entendez souvent des gens qui load autant sous prétexte que le cyto est petit...

Merci d'avance, très bonne journée à tous.

BenCaliF
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[Flyingbike]

c'est beaucoup. Je visualise des récepteurs nucléaires (peu abondants) avec 10µg. Si tu n'as pas de signal, ça n'est pas forcément un problème de quantité.

[mantOs]

Ça dépend vraiment de tes anticorps aussi .

Donner une quantité de protéine minimale n'a de sens que si l'anticorps derrière suit.

[invitef08a311f]

Ok merci les gas,
Bonne journée à vous.

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

60µg c'est vraiment beaucoup. L'expérience montre que si l'on charge trop un gel la migration est pourrie et la détection marche mal. C'est ainsi que parfois, quand on y arrive pas il vaut même mieux diminuer la quantité de protéines chargées plutôt que de l'augmenter.

Cordialement,
piwi