Bonjour tout le monde, je vous sollicite concernant la technologie "Knock Out"!
Je voulais savoir si l'invalidation conditionnelle d'un gène par le syteme Cre/Loxp faisait partie de la technologie K.O c'est à dire peut on dire qu'une souris contenant cette sequence LoxP est KO?
Quel est alors le réel avantage de cette technique, comparé à une souris "KO classique"?
Merci de votre aide
L'avantage c'est que c'est un KO inductible, que tu peux induire en exprimant la Cre recombinase
1. au moment du developpement que tu souhaites, tandis que le KO non conditionnel peut être létal dès la naissance de la souris en fonction du gène ciblé
2. dans le tissu ou organe que tu souhaites en non dans tout l'organisme en exprimant le Cre uniquement à cet endroit
Pour compléter la réponse de Delphinette, le système LoxP est effectivement contrôlable de façon spatiotemporelle puisque le défloxage n'a lieu qu'en présence, dans la même cellule, du gène floxé et de la recombinase Cre.
Ainsi, en choisissant l'expression de la cre dans un tissu donné, en utilisant un promoteur spécifique par exemple, on peut induire l'excision du gène floxé uniquement dans ce tissu.
Il existe aussi des protéines de fusion entre Cre et le domaine de liaison du ligand d'un récepteur aux oestrogènes. Cette protéine n'est capable de transloquer dans le noyau et de reconnaitre les LoxP qu'en présence d'un agoniste du récepteur aux oestrogènes. Ainsi, on peut déclencher le KO par simple injection d'un oestrogène de synthèse.
En combinant ces deux approches, on peut même réaliser un KO spécifique d'un tissu que l'on peut induire au moment souhaité.
Il est aussi possible avec ce système d'activer l'expression d'un gène.
Une souris loxP/gène/loxP n'est pas KO en absence de Cre. Même si c'est différent du KO total classique, les animaux basés sur le modèle Cre/loxP sont quand même qualifiés de KO (inductible, tissu spécifique, ...)
Qu'est ce qui fait la tissu spécificité? Car si j'ai bien compris on utilise des cellules ES donc qui donneront n'importe quel tissu?
Je prend par exemple un gène ubiquitaire, je veux l'invalider que dans le foie, est-ce que je cible mes sequence loxP que sur des ADN de du foie (cela me parait impossible), ou cela concerne t-il la Cre?
merci de ta réponse!
C'es la cre qui est tissu spécfique. Par exemple j'ai des souris KO tissu spécifique dans l'hépatocyte. Toutes leur cellules ont le gène cible floxé. Toutes leurs cellules contiennent un transgène qui code pour la Cre.
MAIS ce transgène est sous le contrôle d'un promoteur spécifique du foie (dans mon cas, albumine ou transthyréthin). Ainsi la cre ne s'exprime que dans le foie et l'excision n'a lieu que dans le foie.
Désolé j'écrivais ma question au moment ou tu ma répondu, c'est clair est limpide maintenant!
Je vous remerci!!
Ce qui fait la spécificité de l'inactivation c'est le choix du promoteur que l'on associe à la Cre.
Vous pouvez voir cet article: http://www.futura-sciences.com/fr/ne...utantes_13390/
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Bonjour !
J'aimerai évaluer in vitro après l'ajout de CRE un modèle KO conditionel pour une proteine X.
Pour étudier l'extinction de la protéine X je ferai une immunofluorescence.
Pour étudier l'extinction de la transcription de la protéine X je ferai une RT PCR.
J'ai du mal à comprendre comment réaliser une cinétique d'extinction de transcription RT PCR.
Quant à l'immunofluorescence il me suffit de fixer mes cellules à differents temps n'est ce pas ?
Merci de votre réponse,
CynMarine
Bonsoir,
Je ne comprends pas bien ce que tu veux faire... Pourquoi tester l'expression d'un gène excisé ?...
Non justement, le gène ne sera excisé qu'après ajout de l'enzyme CRE dans mon milieu.
C'est pourquoi je veux mesurer son extinction dans le temps, pour savoir à partir de combien de temps je peux faire mes analyses in vitro sur le rôle de ce gène. je m'attends à une diminution de l'expression de la protéine et du messager du coup. et j'aimerai mettre en évidence cette diminution.
C'est pour valider le système.
Merci
Bonsoir,
Comme il est expliqué ci dessus, le système Cre/Loxp permet d'invalider d'un gène spatialement et temporellement. Est ce qu'il existe d'autres méthodes pour faire cela ?
Merci
