Choisir le bon vecteur?

[invite6a1a2cd1]

Bonjour,

j'essaye de resoudre un petit probleme dans lequel j'ai un ARNm qui code pour une proteine. Je dois choisir un vecteur pour pouvoir reproduire cette proteine dans une bacterie.
Ma question est la suivante:
Je peux utuliser 3 vecteurs dont je possede les cartes.
Comment choisir le bon vecteur?
Selon quels caracteristiques?
est-ce que je dois essayer de trouver les sites de restriction des enzymes des vecteurs dans la sequences du ARNm et choisir le vecteur qui contient le plus d'enzymes dont les sites de restriction on ete trouve dans l'ARNm?

s.v.p guidez moi
je ne sais pas comment choisir le vecteur convenable.
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[LXR]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Pour choisir un vecteur, il te faut regarder la force de l'origine de réplication (qui détermine le nombre de copies de plasmide dans la bactérie), les résistances aux antibiotiques (sélection des bactéries intégrant le plasmide), la présence d'autres marqueurs de sélection comme la beta-galactosidase, le type de système d'expression (promoteur euca/procaryote, RBS pour traduction chez procaryote,...) ainsi que leur force, la présence d'étiquette peptidique ou protéique (qui permettent de faire de la purification protéique). Voilà pour les caractéristiques générales d'un vecteur. Selon les différentes caractéristiques tu auras donc des plasmides dits d'expression, d'autres de clonage. Donc ton choix s'orientera suivant ce que tu veux faire de ton ARNm (simple clonage ou clonage suivit d'expression,...)

Toi tu veux cloner un ARNm. Il te faut déjà le rétrotranscrire en ADNc. Ensuite la première chose que je ferais dans ton cas c'est un 5'-RACE pour conserver la partie 5' de mon ARNm et pouvoir y coller le site de restriction que je veux. Ensuite pour la partie 3', les ARNm ont en commun une queue polyA donc tu peux t'en servir pour designer l'amorce 3' de la PCR permettant d'amplifier la totalité de ton ARNm, et tu colles en 5' de ton amorce 3' un site de restriction différent. Ainsi tu te retrouves avec un ARNm possédant en 5' et en 3' des sites de restriction connus et différents, ce qui te permet de débuter ton clonage plus efficacement et de choisir un clonage orienté.

Pour définir les sites de restriction que tu utiliseras en 5' et en 3', regardes lesquels ne sont pas présents dans ton ARNm et prend les. Cela t'évitera de cliver ton ARNm par ces enzymes de restriction, mais surtout de cliver spécifiquement les sites que tu as ajouté de part et d'autre de l'ARNm. Pour faciliter ton choix, tu peux sélectionner parmi les enzymes se trouvant dans le polylinker de ton vecteur.

Pour ce qui est finalement du choix du vecteur, il te faut un vecteur contenant une origine de réplication procaryote, un gène de résistance à un antibiotique et pourquoi pas le gène beta-galactosidase à cheval du polylinker (cela permet de sélectionner les bactéries qui ont un plasmide ayant intégré un insert), et bien sûr le polylinker. Voilà le strict minimum qu'un vecteur doit posséder dans ton cas. Maintenant, avec les cartes des plasmides dont tu disposes, il nous serait plus facile de te répondre précisément. Normalement avec les infos que je t'ai donné, tu dois arriver à répondre à ton problème par toi-même.

[invite6a1a2cd1]

ok voici la banque d'adnc qui correspond a l'ARNm:

1........tcatcggctc tgcaccatgg cctccctggc cgcgctcctg cccctgctgg ccctgctggt
61......cctctgcaga ctggatcctg cccaggcctt cgtcaaccag cacctgtgcg gctctcacct
121....ggtggaggcg ctgtacctgg tgtgcgggga gcgcggcttt ttttatacac ccaagtcccg
181....ccgcgaggtg gaggagctgc aggtggggca ggcggagctg ggcggggggc ccggcgcggg
241....cggcctgcag ccctcggcgc tggagctggc cctgcagaag cgcggcatcg tggagcagtg
301....ttgcaccagc atctgctcgc tctaccagct ggagaactac tgcaactagg ggtgcccccc
361....acccacccct gcccgcgccc cccacgcccc ccgccctcgc ccccacccaa taaacccctc
421....cacgcgcccc ggg

j'ai pas compris ce que voulez dire par faire une 5'-RACE
et je trouve pas ma queue poly (A)



par contre, j'ai trouve les sites de restriction pour:
SMAI: ccc ggg (ligne 421)
PVUI: cagctg (ligne 301)
PSTI: ctgcag (ligne 241)
BamHI: ggatcc (ligne 61)
HindIII: aagcct (ligne 61)
Je comprends vraiment pas dans quel direction je men vais.
Je dois choisir l'un des 3 vecteur suivant: pBR322
pGL2
PinPoint Xa-1

[invite76602c99]

t'es en bio à l'udem? le vecteur à expression bactérienne est le PinPoint Xa-1

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite6a1a2cd1]

oui
bon je veux pas juste la reponse
je veux comprendre
ca fait au moins 2 jours que je google la matiere
jai compris le concept, pourquoi on fait ca et en gros comment.
il faut couper le vecteurs par un enzyme de restriction ensuite il faut inserer les meme sites de restriction autour de la sequence d'adn qu'on veut afin qu'on integre la sequence dans le vecteur.
MAIS quel est la sequence d'adn qu'on veut garder pour integre? est-ce tout la sequence? et quel enzyme on utulise...
C'est vraiment pas claire et je comprends pas.

si c'est dans l'examen final, je coule!

[invite76602c99]

moi aussi je comprends pas encore complètement... regarde jvais échanger les réponses avec un gars plus tard et jvais te recontacter par pm pour t'expliquer si tu veux

pm moi ton msn si tu veux

[invite6a1a2cd1]

Quelqu'un pourrait m'expliquer la notion dans ce temps? ou me donner des liens utiles?
j'ai deja vu des presentations power point en ligne qui pourront etre utiles mais malheureusement mon microsoft word ne marche pas :/

[invite3ef76603]

la séquence de ton ADN doit être coupée des deux bords avec la même enzyme que tu utilise pour linéariser le vecteur..de plus, ton site de restriction doit être localisé sur un marqueur de séléction..
par exemple; le pBR322 comprend 2 gènes de résistance l'un à l'ampicilline et l'autre à la tétracycline... celui de la tétracycline contient un site de restriction du BamHI.. ainsi après transformation bactérienne, les bactéries qui ont inclu le vecteur recombinant seront de phénotype Amp R et Tet S..
j'éspère que ca soit clair..sinon n'hésitez pas à demander d'explications

[invite6a1a2cd1]

Votre reponse m'a aide beaucoup (MERCI!!!) sauf qu'il y a toujours quelques points pas si clair:
Vous avez dits que:
1- ma sequence d'adn doit etre coupe des 2 bords par la meme enzyme. Or je retrouve pas le meme site de restriction 2 fois dans ma sequence.
(pour verifier cela, j'ai utulise NEBcutter v2.0 (cliquer sur le mot pour aller au logiciel, pour proceder, j'ai copier ma sequence d'adn la-bas ensuite j'ai cliquer sur submit et j'ai obtenue tout les sites de restriction))
2-Les sites de restriction doivent être localisé sur un marqueur de séléction. Donc si je prends comme exemple le vecteur pBR322, je peux utuliser les enzymes de restriction marquees sur la carte du vecteur, qui sont dans ce cas: PvuII, Sty I, BstZ I, Sal I, Sph I, BamH I, EcoR V, Hind III, EcoR I, Sca I, PvuI, PstI.
Je dois retrouver le site de restriction d'un de ces enzymes 2 fois dans ma sequence d'adn pour la couper?

[invite3ef76603]

contente que vous avez compris le truc
aprè avoir copier votre séquence dans le logiciel, cliquez sur 2 cutter c en bas dans display. ça va vous donner les nom des enzymes qui coupent 2 fois sur la même séquence.. é puis revenez au menu principal et choisissez le vecteur que vous voulez.. aprez sur "custum digest" et mettez les nom des enzymes que vous avez trouvé précédement.. et voilà..
merci pour le logiciel c trèèèèèè intéréssant..c la première fois que jl'utilise

[invite3ef76603]

oups... je croix que j vous ai rendu la vie difficile..
vous pouvez utilisez 2 enzymes de restrictions aussi..mais cette fois vous allez remplacer une séquence du vecteur (elle va être coupée par 2 enzymes différents, chaqu'un d'un coté )par votre séquence d'ADN (qui va être aussi coupée par lé deux)..:P

[invitedecb7db9]

Bonjour a tous
Je suis dans le meme cas que "gojonnygo" et je comprend vraiment pas comment choisir le bon vecteur d'expression..??!

s'il vos plait aidez moii!!!

merci d'avance!

[invite2fb83916]

Pouvez - vous preciser un petit peu plus?
Que ne comprenez - vous pas? Quel type de plasmide? Avez - vous une carte de restriction? ...

[invitedecb7db9]

ouai en fait je ne comprend pas pourquoi c'est pinpoint va-1 qui est le bon vecteur d'expression, et je ne vois pa comment je pourrai justifier mon choix...

[invitecced5e33]

Salut !

J'ai moi aussi de la difficulté a trouver un vecteur approprié, Et Je ne comprend pas pourquoi le bon vecteur dans cet exemple serait PinPoint xa-1 ? Selon ce que j'ai vu il ne possede pas de sites de restriction communs avec la sequence d'ADNc dans sa region du gene de resistance ?? Je ne comprend pas d'ailleurs pk le site de restriction doit se trouver dans la sequence de resistance a l'antibiotique et non ailleurs dans le plasmide ?

J'aurais plutot tendance a penser que c'est plutot pBR322 ?? mais j'ai de la difficulté a comprendre les differences entre les vecteurs quant a leur efficacité.

quelqu'un pourrait m'eclairer la dessus ?
Merciiii !

[biomol05]

Salut, j'ai la même question que gojonnygo, est-ce que qqun peut m'expliquer la raison principale pour laquelle je choisirais le vecteur PinPoint Xa ?

[invite49a79edb]

Sinon Quelq'un a t-il comprit ses 2 numéros :

1- Vous désirez ensuite créer une souris transgénique qui exprimera cette protéine en fusion avec
la protéine GFP. Vous devez donc introduire dans des cellules ES un transgène contenant la
séquence de GFP et la région codante de votre nouvelle protéine en phase, et sous le contrôle d’un
promoteur. Pour créer votre ADN recombinant, vous devrez utiliser le site EcoRI (GAATTC) présent
à la fin de la séquence GFP dans votre vecteur. La fin de la séquence de GFP est représentée
ci-dessous. Les triplets vous indiquent le cadre de lecture:
...TCC GGC CGG ACT CAG ATC TCG AGC TCA AGC TTC GAA TTC TGC ...
Proposez une amorce de 20 nucléotides incluant le site EcoRI qui vous permettra, avec une
autre amorce antisens (non montrée), d’amplifier spécifiquement la région codante pour l’insérer
dans cette construction en phase avec GFP.
Réponse:...

2- Une fois inséré dans le génome de la souris, cette construction donnera une protéine chimérique
GFP-X. Pour que cette protéine s’exprime spécifiquement dans les fibroblastes, par exemple,
la séquence transgénique devra être insérée à proximité de séquences régulatrices dirigeant
l’expression dans les fibroblastes. Expliquez comment l’expression du transgène peut être guidé
par le choix du promoteur et des séquences régulatrices.

Réponse: ...

[piwi]

Votre exercice contient les infos sur les plasmides et la réponse. Vous ne savez pas lire?
Je suis un peu exaspéré parce que ça commence à faire beaucoup de personnes qui viennent avec la même question...

piwi

[piwi]

J'ai été un peu dur hier soir, je m'en excuse. Cependant, je maintient que tout se trouve dans votre document de travail et que la leçon à retenir pour les personnes qui ont cet exercice à faire et qui viennent sur ce forum (je crois que c'est la première fois que je vois autant de personnes venir pour exactement la même question) est que (1) il faut mieux lire l'énoncé et (2) back to basic, si ça coince, c'est neuf fois sur dix que le cours n'est pas parfaitement compris.

Vous cherchez un vecteur qui va permettre d'exprimer votre protéine d'intérêt Sans même regarder la carte de restriction et s'y connaître même un minimum en biologie moléculaire, on peut lire ceci dans la première phrase des documents qui vous sont fournis pour chacun des vecteurs:
pBR322: The plasmid pBR322 Vector (4,361bp) carries the genes for tetracycline and ampicillin resistance.
pGL2 : The pGL2 Luciferase Reporter Vectors provide a basis for the quantitative analysis of factors that potentially regulate mammalian gene expression.
PinPoint : The PinPoint™ Xa Protein Purification System is designed for the production and purification of fusion proteins that are biotinylated in vivo.

Il n'y a aucune ambiguïté nul part, C'est écrit en toute lettre!
Alors, si on veut être un rien sarcastique dans ses réponses, on peut écrire que l'élément qui a guidé votre choix est la lecture de la doc ^_^. Maintenant, je ne pense pas que cela soit la réponse attendue
pBR322 est vraiment le vecteur de base. C'est je pense, le premier que l'on a du vous présenter. C'est un vecteur de clonage qui contient simplement: une ori de réplication, un gène de résistance (Amp^r pour les procaryote, Tet^r pour les eucaryotes), et une cassette de clonage. La séquence insérée là dedans ne sera qu'amplifiée, jamais exprimée étant donné qu'il n'y a pas de promoteur de transcription.
pGL2 est un vecteur un peu plus compliqué: On trouve une f1 ori + polyA coding sequence qui a du vous perturber. Cette construction sert à produire de l'ADN simple brin, si besoin. La polyA cs juste derrière sert à insérer un terminateur histoire d'éviter qu'un promoteur cryptique ne vienne produire des transcrits non désirés (réducteur de bruit de fond). En suite on trouve les choses pertinentes pour votre travail. Deux cassettes de clonages qui entourent le gène de la luciférase + polyA cs. L'idée de ce vecteur est de cloner des promoteurs ou des séquences régulatrices pour tester dans quel mesure des facteurs cis et trans activateurs peuvent activer la transcription de la luciférase. Ce vecteur ne sert donc pas à produire n'importe quelle protéine mais à mettre les séquences qui vont permettre de promouvoir la transcription du gène rapporteur luciférase.
PinPoint contient un promoteur tac de transcription suivi de la séquence d'un tag-Xa. Le tag est un petit peptide qui permet de purifier la protéine indépendamment de la protéine d'intérêt, il est suivi de Xa qui est une protéine qui peut être clivée et permet de donc de retirer le tag après purification pour n'avoir plus que la protéine native. On trouve derrière la cassette de clonage pour insérer votre protéine d'intérêt. C'est donc un vecteur de choix pour la production (il porte un promoteur de transcription) et la purification (un tag excisable) des protéines.

Voilà voilà.

Cordialement,
piwi

[werranga]

Hormis certaines remarques faites ci haut ,on doit prendre aussi en compte le fait que le clonage depend de l'objectif du travail.Si par exemple on veur cloner l'ORF tout entier ,on fait le choix de 2 sites de restriction enzymes teste au prealable car les 2 sites,il ne faut pas que ils se retrouvent dans le gene,en plus pour l'orientation du gene et aussi en fonction de disponibilite des enzymes de restriction au laboratoire.La lecture de la carte est tres importante ,mais aussi la disponibilite de vecteur et enzyme restriction .