Bonjour,
Petit problème de laboratoire, et plus précisément dans l'écriture de mon rapport. Lors d'une électrophorèse, on a préparé un gel de polyacylamide avec un gel de stacking et un gel de séparation.
J'ai bien compris à quoi sert le gel de stacking ( à ce que l'échantillon soit concentré sur une bande très fine avant d'entrer dans le gel de séparation ), mais par contre, je n'ai pas du tout compris son fonctionnement...
Quelqu'un pourrait-il m'éclairer un peu?
Merci.
Hello, cette page explique bien le fonctionnement du stacking gel, à mon avis:
http://pages.usherbrooke.ca/bcm-514-bl/5b.html
Y'a même un schéma !
Le stacking gel est simplement un gel très faibelemnt concentré en bis-acrylamide (ou autre), pas suffisamment pour séparer les protéines, donc elles migrent toutes en même temps, tout poids moléculaires confondus.
Il n'y a pas que la concentration en polyacrylamide qui joue sur la concentration de la bande de dépôt. Le pH du Stacking y joue beaucoup aussi. Il définit un état de charge des ions qui constituent le flux électrophorétique. Le flux électrophorétique est donc différent du flux observé dans le séparating et surtout favorable à une organisation ionique qui favorise la concentration de la bande de dépôt.
Une bonne source en ce qui concerne l'explication de la méthode complexe du western blot : http://www.cours-de-biochimie.fr/western.php
merci pour les deux liens, ils sont vraiment intéressants et bien expliqués, mais il y a juste un passage que je ne comprend pas:
Vu que le front d'arrière-garde avance plus lentement que le front pilote, les deux fronts vont être de plus en plus éloignés l'un de l'autre non? en quoi ça participe à la concentration de l'échantillon? Et qu'est-ce que la quantité de protéine-SDS vient faire là dedans?Une fois les composés ioniques " rangés " selon leur ordre de mobilité (on parle alors de pile ou d'empilement) la concentration molaire des protéines devient du même ordre de grandeur que celle établie pour les tampons pilotes et d'arrière garde. Ce qui correspond à une concentration massique de protéines de l'ordre de 10 à 100 mg/ml. Comme la quantité de complexe protéines-SDS est faible, il va se concentrer en une bande très fine entre les ions chlorures et les ions glycinates.
Avant de lancer la migration, les ions pilotes et d'arrière-garde sont mélangés dans le tampon. C'est lorsqu'ils sont soumis au courant électrique qu'ils migrent dans le gel et s'organisent en fonction de leur mobilité. La distance de migration dans le stacking est relativement courte. On ne peut pas parler de séparation des différentes espèces chimiques. Elles ont juste le temps de s'organiser en trois bandes très proches, sous la forme d'un empilement. C'est pour cette raison que ce phénomène physico-chimique participe à la concentration de la bande protéine-SDS.Vu que le front d'arrière-garde avance plus lentement que le front pilote, les deux fronts vont être de plus en plus éloignés l'un de l'autre non?
Pour être plus clair, imagine une bande de 1 cm de largeur constituée d'un mélange homogène de 3 espèces chimiques, chaque espèce chimique étant donc répartie de façon homogène dans ce cm de largeur. En les faisant migrer tu obtiens une bande de 1 cm de largeur mais avec les 3 espèces chimiques séparées au sein de la bande. Cela fait donc 0.33 cm pour chaque espèce, tu les as donc concentré de 3 fois. C'est ce principe qui est utilisé dans le stacking, et qui ressemble à une chromatographie qu'on stopperait dès l'organisation des différentes espèces chimiques selon leur mobilité, donc avant leur séparation proprement dite.
C'est l'espèce chimique qui t'intéresse le plus, le but du stacking est justement de concentrer cette espèce.Et qu'est-ce que la quantité de protéine-SDS vient faire là dedans?
voilà qui est beaucoup plus clair
merci beaucoup, j'y comprend enfin quelque chose
