question sur la QPCR

[invite036c0897]

Bonjour,

Je suis actuellement devant un problème de compréhension de la PCR quantitative.

Nous avons eu un TP de détection de microorganismes sur échantillon de carotte. Il nous faut à la suite de la QPCR, faire tout un calcul à partir du Ct.

Cependant, nous avons comme données, le nombre d'avogadro et la taille du génome de la carotte.

A la fin de notre QPCR, nous avons une quantité totale d'ADN de 10ng/mL (ADN carotte + ADN microorganisme si j'ai bien compris).

Je ne sais vraiment pas comment interpréter mes résultats.

Please help me !

Marion
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[kamor]

Logiquement tu dois avoir une gamme d'étalonnage, c'est à dire des puits où ont été mis des quantités connue d'ADN d'intérêt. Grâce à ces puits, on peut tracer une droite reliant les Ct et les quantités d'ADN. Avec la taille du génome et le nombre d'Avogadro, tu peux calculer combien de cellules il a fallu lyser pour obtenir cette quantité d'ADN (ce qu'on appelle équivalent génome).
Après ça s'utilise comme n'importe quelle courbe d'étalonnage.

[invite036c0897]

Tout d'abord, merci de votre réponse,

J'ai bien une gamme d'étalonnage avec des concentrations connues. Nous avons réalisés des dilutions au 10ème d'une solution mère à 10ng/mL (4 dilutions successives). J'ai donc calculer à partir de la concentration mère les concentrations filles en divisant par 10 à chaque dilution.

Ensuite, j'ai 3 répétitions pour chaque dilution, j'ai donc fais la moyenne des 3 Ct à chaque dilution.

Je vais donc faire une courbe d'étalonnage. Me conseillez vous une quelconque technique? On m'a conseiller d'utiliser le logiciel "R" et de mettre en abscisse Log de N (sachant que N=2-Ct x a) et en ordonnée le Ct.

Après pas de soucis pour déterminer les concentrations de mes échantillons.

Un échantillon avec de l'eau ne peut pas avoir de Ct? Peut on parler de contamination ou d'erreur de manipulation?

Merci de votre aide!

Juste pas curiosité, vous travaillez dans ce domaine?

[kamor]

La droite d'étalonnage doit être faite pour qu'à un Ct corresponde X. après que X soit un éq génome, une quantité d'ADN ou une unité arbitraire, je dirais que c'est à toi de décider laquelle te sera la plus utile par la suite.
Pour la technique je peux pas dire, mon logiciel de PCR temps réel fait la courbe et me donne l'équation tout seul. (Le logiciel vaut 3 000€, un peu cher pour une utilisation). Sinon Excel ou son équivalent Open Office peut faire ça. Graphique -> Nuage de points -> afficher le R2 et l'équation dans ses options si mes souvenir sont pas mauvais.

Pour l'eau... ça dépend. Personnellement on m'a toujours appris qu'un Ct supérieur à 30 pouvait être considéré nul et dans mes manips c'est le cas. Si tu as un témoin positif (tu peux considérer ton échantillon de gamme étalon non diluée comme tel) qui sort à 20 et ton témoin négatif sort à 30, ça fait quand même une grosse différence, 2^10. A partir de 30, on considère souvent que l'amplification devient aspécifique. Par contre si ton négatif a un Ct proche d'un positif... aie. Là oui, il y a problème. Soit contamination d'un constituant de ton mix, soit mauvaise manip, tu as mis dans ton négatif l'ADN d'un autre puits. Qui pourrait alors servir de négatif.

Par curiosité aussi, je fais de la biologie moléculaire sur les bactéries

PS : sur tes triplicats, tu peux t'amuser à calculer l'écart type, on considère qu'un bon manipeur a des écarts type inférieur à 0.2. Au dessus, les écarts peuvent t'être imputés Ou au matériel, celui des TP est rarement de première jeunesse et les conditions sont souvent pas optimales quand même.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite036c0897]

Ouahhhh de la biomol sur bactéries !!! Je dit ca car personellement je voudrais travailler dans la recherche sur les intéractions plantes/bactéries.

Ca me passionne beaucoup!

Merci pour vos réponses!

J'en ai encore une autre (désolée), pour calculer un nombre de cellules d'un mix étalon avec le nombre d'avogadro, dois-je utiliser la concentration?

[invite036c0897]

Au passage, vu que vous travaillez sur bactéries. Savez-vous pourquoi on amplifie la région 16S dans un diagnostic ? Pourquoi tout simplement ne pas utiliser seulement la région spécifique de la bactérie car si j'ai bien compris la région 16S est identique pour n'importe qelle bactérie....

[Chewee]

Au passage, vu que vous travaillez sur bactéries. Savez-vous pourquoi on amplifie la région 16S dans un diagnostic ? Pourquoi tout simplement ne pas utiliser seulement la région spécifique de la bactérie car si j'ai bien compris la région 16S est identique pour n'importe qelle bactérie....

Peut être pour des questions de normalisation ?

[Chewee]

Personnellement on m'a toujours appris qu'un Ct supérieur à 30 pouvait être considéré nul et dans mes manips c'est le cas.

Cela dépend quand même de bon nombre de paramètres, comme les mix utilisés, la sensibilité des appareils et surtout la limite de linéarité pour une cible donnée. J'aurais tendance, par expérience, à définir ce seuil à 35.

Pour obtenir un seuil précis, il est possible de réaliser une gamme de cDNA et de tester la limite de détection en dilution limite.

Par exemple, je travaille sur des cibles très faiblement exprimées, pour lesquelles après un gros effort sur le design des primers il est possible de détecter un signal spécifique et linéaire jusqu'à 36 Ct, les blancs et autres contrôles nég n'étant pas détecter à 40 Ct... Et les courbes de melting confirmant la spécificité de l'amplicon.

Évidement dans la plupart des cas de figure une telle sensibilité n'est pas utile, une simple comparaison entre les blancs et les points de mesure suffisent (plus il y a de différence, mieux c'est....).

[invite036c0897]

On utilise donc les amorces pour amplifier la région 16S des bactéries selon une norme, mais savez-vous laquelle? Je cherche mais sur Afnor, la consultation est payante

[kamor]

Cela dépend quand même de bon nombre de paramètres, comme les mix utilisés, la sensibilité des appareils et surtout la limite de linéarité pour une cible donnée. J'aurais tendance, par expérience, à définir ce seuil à 35.

Ce que j'ai précisé et aussi la raison de l'ajout du "Personnellement" en début du message cité.

Ben parce que seules les bactéries (enfin bon, sujet à polémique, c'est pas totalement vrai mais bon) ont des séquences 16S. Donc si y a une amplification (et que l'amplicon est de la bonne taille), c'est donc qu'il y a au moins une espèce bactérienne dans votre échantillon.

Après attention. Des parties du 16S sont effectivement très conservées (et je remesure tout ce que j'ai oublié de la fac... on m'avait fait apprendre ces séquences conservées ). Mais ce n'est pas la totalité de ce gène de 1500 nt. On peut très bien effectuer des PCR spécifiques sur le 16S. C'est un peu plus ardu, c'est tout. C'est juste une question d'emplacement des amorces.

[Chewee]

Ce que j'ai précisé et aussi la raison de l'ajout du "Personnellement" en début du message cité.

Ce n'était également qu'une réflexion personnelle, le but de ce genre de discussion n'est-il pas justement l'échange de différentes expériences?

Bien à toi, Kamor...

[kamor]

Je suis totalement d'accord. C'est assez difficile à appréhender, surtout que je me souviens que mes profs me l'avaient présenté d'une façon très simpliste. On m'avait dit "première étape 95°C, deuxième étape 55°C, 3ème étape 72°C". Quand on commence à jouer avec, on se rend que c'est un peu plus compliqué que cela. Tout peut varier, et tout aura une conséquence sur le résultat obtenu.
Disons que c'est une règle observable dans les cas d'école, mais comme tout il faut rester assez critique envers ces résultats. De toute façon, c'est le but de l'exercice