Bonjour à tous, je suis nouvelle membre et j'ai besoin d'une petite explication qui peut paraitre un peu bête mais ... on ne se refait pas.
A quelle étape intervient le sous clonage lorsque l'on constriut une banque d'ADNc est-ce uniquement lors de l'exision du gène d'intérêt où la construction de la banque elle même passe par un sous clonage ? je suis un peu perdue...
Merci d'avance
Salut la nouvelle,
j'ai peur de ne pas comprendre ta question lorsque tu parles de "sous-clonage"[B][COLOR=Indigo], mais je peux t'expliquer comment on fait une banque d'ADNc en espérant que tu y trouveras ton compte.
De toute façon je ne m'en fais pas pour toi, Vinc devrait y arriver...
Construction d’un vecteur d’expression
1.Isoler la séquence à exprimer : préparer un ADNc
•cellules ou tissu producteurs de la protéine d’intérêt,
•extraction des ARN totaux,
•purification des ARN messagers (1 à 2 % du total) : les ARNm possèdent une queue poly-A et peuvent être isolés par chromatographie sur colonne oligo-dT.
•Synthèse d’un ensemble ADNc par transcription inverse:
Transcriptase inverse + dNTPTTTTT 5’
RNAase + ADN polymérase + dNTPTTTTT 5’
Synthèse de l’ADNc double brin
Amplification sélective de l’ADNc ciblé par PCR et choix des amorces.
2. Insertion de l’ADNc dans le vecteur d’expression
•digestion de l’ADNc et du vecteur par la même enzyme de restriction,
•recombinaison chimique et ligation par l’ADN ligase : ADN recombinant,
•contrôle-qualité de l’ADN recombinant : transformation dans E. coli, sélection des clones recombinants et extraction du vecteur d’expression.
3. Préparation de grandes quantités de vecteur,
4. Insertion dans la cellule-hôte.
@+
Salut!
Non tu as très bien expliqué!Envoyé par delirium539
De toute façon je ne m'en fais pas pour toi, Vinc devrait y arriver...
Juste pour le fun, il y a une exeption à cette "règle"!
Les ARNm des histones ne possèdent pas de queue polyA!
A+
Vinc
Primum non nocere.
MERCI BOCOU mais il y a encore deux ou trois trucs pas très clairs...
La méthode que Delirium m'a gentiement indiqué permet directement une sélection spécifique de l'Adnc avant clonage puisqu'on utilise des amorces spécifiques lors de l'amplification mais la sélection des clones d'intérêt au sein d'une banque d'adn na se fait-elle pas ensuite (une fois la banque construite) par criblage (hybridation avec une sonde specifique) ? où bien quel est l'intérêt de la banque...
Bonsoir
La methode indiquée peut etre utilisée seulement quand tu cherches a cloner l'ADNc d'un gene connu (afin notament de le cloner sans ses introns), mais evidemment tu ne peux pas partir a la peche aux genes inconnus (sauf a utiliser des amorces dégénérées calculées a partir de regions hautement conservées dans les protéines de cette famille.
Mais dans ce cas il n'y a pas de banque d'ADNc a proprement parler.
Une banque d'ADNc correspond aux clonages de tous les ADNc obtenus dans un vecteur. Cette banque est alors utilisée dans un crible afin d'identifier le clone possédant le(s) gene(s) recherché(s). Une fois les clones identifiés, il s'agit de preparer les plasmides et de les sequencer afin de caracteriser le fragment cloné.
Il peut etre necessaire de recloner le gene identifier afin de pouvoir l'etudier plus en detail.
Yoyo
L'interêt d'une banque de cDNA comme son nom l'indique c'est de représenter un capital de gènes connus ou inconnus. La fabrication peut se gfaire soit en utilisant comme amorces des hexamers aléatoires ou bien des polyT ce qui permet en théorie de recopier tous les ARN messager possédant une queue 3' polyA.MERCI BOCOU mais il y a encore deux ou trois trucs pas très clairs...
La méthode que Delirium m'a gentiement indiqué permet directement une sélection spécifique de l'Adnc avant clonage puisqu'on utilise des amorces spécifiques lors de l'amplification mais la sélection des clones d'intérêt au sein d'une banque d'adn na se fait-elle pas ensuite (une fois la banque construite) par criblage (hybridation avec une sonde specifique) ? où bien quel est l'intérêt de la banque...
Pour la sélection elle peut se faire de pleins de méthodes différentes suivant le type de Banque réalisée
1/ Banque de cDNA dans un vecteur plasmidique classique
Hybridation avec une sonde dite "Spécifique" soit simple soit par comparaison entre deux banques construites avec des cellules traitées différemment
Type de culture.: Avec facteurs de croissance ou sans
infectées ou non infectées
En croissance ou en quiescence
etc......
2/ Banque de cDNA dans un vecteur d'expression bactérien
Les cDNA clonés sont traduits en protéines par expression dans E.Coli et les protéines recombinantes ainsi exprimées sont détectés par
des anticorps mono ou polyclonaux
test enzymatique recherche d'activité de la protéine d'interêt
2/ Banque de cDNA dans un vecteur d'expression eukaryote
La banque est transfecté dans des cellules permettant l'expression des protéines soit à la surface des cellules: Cellules COS par exemple
et la détection/sélection se fait par l'utilisation d'anticorps
la Banque peut également etre transfecté puis la sélection se fait sur la base des critères des cellueles transformées Expression d'un oncogène rendant les cellules immortelles ou poussanrt sur des milieux sélectifs et autres
Bref les possibilitées sont quasi infinies ce qui limite c'est toujoursles critères de sélection
La banque doit normalement contenir au moins un exemplaire de chacun des ARN messager de la cellule étudiée.
Voilà c'est assez complexe mais j'espère avoir été clair !
Pesji
Merci à tous les deux j'avais compris "en gros" mais il me manquait des détails maintenant c'est beaucoup plus clair!
Ok pour la transcription inverse mais à la fin de la transcription, la RNAase H fait son travail et dégrade l'ARN. On se retrouve alors avec un ADNc simple brin.
Comment obtiens-tu un ADNc double brin?
Tu renvoies deux amorces spécifiques et une ADN polymérase?
Petits schémas pratiques et explicatifs sur les cDNA...
Bonjour, j'aurais une question a propos de ce sujet...
Quand on veut cribler une banque d'ADNc avec une sonde ADN marquée, il faut dénaturer avant le vecteur (le plasmide par exemple)???
Sinon je ne vois pas comment la sonde peut s'hybrider..Mais pour dénaturer le plasmide il faut augmenter la température, ça ne tue pas les E. Coli par exemple?
Merci d'avance
de toute facon il faut bien casser les cellules d'E. coli pour que ta sonde atteigne l'ADN plasmidique.
YOyo
Hein, hein...Je n'avais pas vu ça comme ça
Merci pour votre réponse YoYO...
Donc, en fait quand on fait un criblage la banque est détruite. Si l'on veut utiliser le vecteur qui contient l'ADNc d'interrêt il faut re-transfecter des bactéries? Ai-je bien compris?
En cours on nous parle beaucoup de la théorie, aprés pour la pratique, c'est pas trés appronfondi..
Hello,
On est tous passés par là
Ta banque ne contient pas des cellules : tu te fiches des cellules en gros. Ta banque contient les fragments de ton ADN d'intérêt insérés dans des vecteurs (plasmides, cosmides, YACs, BACs,...). Donc, non, ta banque n'est pas détruite; les cellules portant les vecteurs sont détruites, mais tu le fais dans le but d'extraire ces vecteurs justementDonc, si tu veux utiliser l'ADN contenu, tu peux. Si tu veux l'utiliser pour re-transformer /re-transfecter des bactos, tu peux aussi
Hope that helps
Cordialement,
An expert is one who knows more and more about less and less.
je suis en master 1....
J'aurais pu y penser toute seule j'avoue.....Pour moi l'interret c'était d'avoir la bactérie avec le plasmide, et aprés de cultiver cette bazctérie pour multiplier l'ADNc...Mais c'est vrai qu'on peut retransfecter, alors le problème est résolu...
Encore merci!!
Moi aussi
Beh, tu introduis dans des bactéries pour obtenir une quantité de plasmides élevée et puis tu extraies cet ADN. Mais le truc est que ta banque n'est pas les cellules, ta banque est toutes les copies des fragments d'intérêt que tu souhaites (représenté chacun une 10aine de fois, je crois, pour être certain que tout le génome est couvert).J'aurais pu y penser toute seule j'avoue.....Pour moi l'interret c'était d'avoir la bactérie avec le plasmide, et aprés de cultiver cette bazctérie pour multiplier l'ADNc...Mais c'est vrai qu'on peut retransfecter, alors le problème est résolu...
Encore merci!!
Ensuite, une fois que tu as tout ça, tu transformes pour voir des phénotypes associés à des mutations, des sauvetages de phénotypes ou ce que tu cherches
Cordialement,
Dernière modification par MaliciaR ; 02/06/2008 à 13h41.
An expert is one who knows more and more about less and less.
Des stages oui j'en ai fait, mais j'ai jamais fait de manip sur les bactéries, ou manipuler des banques (ne parlons même pas des TP....Sujet qui fache...)
C'est pour ça que techniquement je voyais pas comment on faisait l'hybridation sur la banque. C'est plus clair maintenant.
Bonjour.
Je me permets de continuer cette discussion sur les banques ADNc car un problème se pose à moi.
Je suis en train d'essayer de comprendre -via leur notice-, le système de Zap2/bluescript de Stratagène pour la construction de banque.
Je n'arrive pas à comprendre la stratégie utilisée ni l'intérêt d'utiliser cette technique par rapport à un clonage "classique". Quant aux subtilités de la démarche...
Si je pouvais avoir un peu d'aide...
Merci par avance
Re : Construction d'une banque d'ADNc
personne ne saurait m'avancer, rien qu'un peu? :'(
Re : Construction d'une banque d'ADNc
Je ne comprends vraiment pas comment agit le phage helper... personne? :'(
Je me permet de rajouter un petit texte que j'ai écris récemment sur une suite logique à la formation d'une banque d'ADNC. Comme il a été dit, le but d'une telle banque est la réalisation d'un crible. Cependant, comme on a réalisé la banque à partir de l'ensemble des ARNm polyA d'une (ou plusieurs) cellule(s), il y a de grandes redondances dans la banque. Pour s'astreindre de la redondance, on peux vouloir "normaliser" la banque :
À ce stade, nous sommes en présence d’une banque d’ADNc. Cependant, dans une cellule, les ARNm sont grandement redondants. Les gènes les plus fortement exprimés peuvent être présent à plus de 5000 copies chacun. Nous souhaitons nous débarrasser de cette redondance pour que le crible que nous réaliserons ne nous fournisse pas plusieurs dizaines ou milliers de fois le même candidat. Pour cela nous allons suivre un procédé décrit par Bento Soares en 1994, la normalisation des banques d’ADNc par cinétique d’hybridation. (5). Cette technique se base sur le fait que, plus un ADN déterminé est présent dans une population d’ADN et plus rapidement, après dénaturation il sera ren aturé.
La mise en place de cette technique nécessite l’obtention d’ADNc simple brin. Pour cela, nous transformerons des bactéries compétentes avec notre banque d’ADNc. Ensuite, nous surinfecterons ces bactéries par le phage à ADN simple brin M13K07. Nos plasmides d’ADNc contiennent l’origine de réplication de ce phage, donc, quand il se répliquera (en ADN simple brin) nos plasmides d’ADNc seront eux aussi répliqués en ADN simples brins. C’est à partir de ces ADNc simple brin que nous pourrons normaliser notre banque. Il nous faut créer des ADNc partiellement doubles brins. Pour cela, nous utilisons une amorce commune à tous les plasmides simples brins contenant l’ADNc. Cette amorce s’hybridera en amont du site d’insertion de l’ADNc dans le plasmide. On entamera une polymérisation d’environ 200 nucléotides. Étant donné le sens de polymérisation choisi, ces 200 nucléotides seront complémentaires de la séquence en 5’ de l’insert. Ainsi la séquence polymérisée sera spécifique pour chaque espèce d’ADNc de la banque. Puis, nous dénaturerons ces duplexes. Enfin en entamant la renaturation de ces duplexes, les espèces majoritaires seront les premières à se renaturer. Ainsi, en arrêtant la renaturation avant que tous les duplexes soient renaturés, seules les espèces les plus présentes dans la banque seront renaturées. Et l’expérience a montré, que dans ces conditions, les ADNc qui restent simple brin, représentent uniquement quelques exemplaires de chaque espèce d’ADNc de la banque. Ainsi en séparant à cette étape les ADNc simple brin, des ADNc partiellement doubles brins, nous éliminerons la redondance de notre banque d’ADNc. Dans la pratique, pour séparer les ADNc simple brin des ADNc partiellement double brins, nous pouvons utiliser des amorces biotinylées pour créer le double brin partiel et séparer les doubles brins à l’aide de colonnes de streptavidine (voir Figure 5). Les doubles brins seront retenus dans la colonne et les simples brins récupérer. (Il est a noté qu’il peut être nécessaire de recommencer une seconde fois l’opération pour maximiser la diminution de la redondance). Enfin, nous convertirons ces ADNc simple brin en double brin partiel, en réalisant une polymérisation ménagée à l’aide de la même amorce que précédemment, mais non biotinylé. Puis, ils seront électroporés dans des bactéries compétentes. Les bactéries transformées permettront de rendre les ADNc entièrement doubles brins. Cependant, pour ne pas avoir, lors du crible à tester individuellement chaque espèce d’ADNc de la banque, nous diviserons cette banque. Une banque d’ADNc normalisé contient classiquement 106 ADNc différents. Nous diviserons celle-ci en 1000 lots de 10^3 ADNc différents. Et chacun des lots sera testé selon la méthode décrite dans le paragraphe réalisation du crible. Pour les lots entraînant l’effet rechercher, nous les re-diviserons en sous-lots, et réitèrerons la méthode, jusqu'à obtenir le ou les ADNc d’intérêt.
Bonjour, moi je suis nouvelle ici et je suis en Licence 3 de génomique et la vous venez de m'aider à comprendre mon cours sur les banques d'ADNc alors merci
