Construction d'une banque d'ADNc

[mimosa]

Bonjour à tous, je suis nouvelle membre et j'ai besoin d'une petite explication qui peut paraitre un peu bête mais ... on ne se refait pas.
A quelle étape intervient le sous clonage lorsque l'on constriut une banque d'ADNc est-ce uniquement lors de l'exision du gène d'intérêt où la construction de la banque elle même passe par un sous clonage ? je suis un peu perdue...
Merci d'avance

[delirium539]

Salut la nouvelle,

j'ai peur de ne pas comprendre ta question lorsque tu parles de "sous-clonage"[B][COLOR=Indigo], mais je peux t'expliquer comment on fait une banque d'ADNc en espérant que tu y trouveras ton compte.
De toute façon je ne m'en fais pas pour toi, Vinc devrait y arriver...

Construction d’un vecteur d’expression
1.Isoler la séquence à exprimer : préparer un ADNc
•cellules ou tissu producteurs de la protéine d’intérêt,
•extraction des ARN totaux,
•purification des ARN messagers (1 à 2 % du total) : les ARNm possèdent une queue poly-A et peuvent être isolés par chromatographie sur colonne oligo-dT.
•Synthèse d’un ensemble ADNc par transcription inverse:
Transcriptase inverse + dNTPTTTTT 5’
RNAase + ADN polymérase + dNTPTTTTT 5’
Synthèse de l’ADNc double brin
Amplification sélective de l’ADNc ciblé par PCR et choix des amorces.
2. Insertion de l’ADNc dans le vecteur d’expression
•digestion de l’ADNc et du vecteur par la même enzyme de restriction,
•recombinaison chimique et ligation par l’ADN ligase : ADN recombinant,
•contrôle-qualité de l’ADN recombinant : transformation dans E. coli, sélection des clones recombinants et extraction du vecteur d’expression.
3. Préparation de grandes quantités de vecteur,
4. Insertion dans la cellule-hôte.

@+

[Vinc]

Salut!

De toute façon je ne m'en fais pas pour toi, Vinc devrait y arriver...

Non tu as très bien expliqué!

les ARNm possèdent une queue poly-A

Juste pour le fun, il y a une exeption à cette "règle"!
Les ARNm des histones ne possèdent pas de queue polyA!

A+
Vinc

[mimosa]

MERCI BOCOU mais il y a encore deux ou trois trucs pas très clairs...
La méthode que Delirium m'a gentiement indiqué permet directement une sélection spécifique de l'Adnc avant clonage puisqu'on utilise des amorces spécifiques lors de l'amplification mais la sélection des clones d'intérêt au sein d'une banque d'adn na se fait-elle pas ensuite (une fois la banque construite) par criblage (hybridation avec une sonde specifique) ? où bien quel est l'intérêt de la banque...

[Yoyo]

Bonsoir

La methode indiquée peut etre utilisée seulement quand tu cherches a cloner l'ADNc d'un gene connu (afin notament de le cloner sans ses introns), mais evidemment tu ne peux pas partir a la peche aux genes inconnus (sauf a utiliser des amorces dégénérées calculées a partir de regions hautement conservées dans les protéines de cette famille.
Mais dans ce cas il n'y a pas de banque d'ADNc a proprement parler.

Une banque d'ADNc correspond aux clonages de tous les ADNc obtenus dans un vecteur. Cette banque est alors utilisée dans un crible afin d'identifier le clone possédant le(s) gene(s) recherché(s). Une fois les clones identifiés, il s'agit de preparer les plasmides et de les sequencer afin de caracteriser le fragment cloné.
Il peut etre necessaire de recloner le gene identifier afin de pouvoir l'etudier plus en detail.

Yoyo

[pesji]

MERCI BOCOU mais il y a encore deux ou trois trucs pas très clairs...
La méthode que Delirium m'a gentiement indiqué permet directement une sélection spécifique de l'Adnc avant clonage puisqu'on utilise des amorces spécifiques lors de l'amplification mais la sélection des clones d'intérêt au sein d'une banque d'adn na se fait-elle pas ensuite (une fois la banque construite) par criblage (hybridation avec une sonde specifique) ? où bien quel est l'intérêt de la banque...

L'interêt d'une banque de cDNA comme son nom l'indique c'est de représenter un capital de gènes connus ou inconnus. La fabrication peut se gfaire soit en utilisant comme amorces des hexamers aléatoires ou bien des polyT ce qui permet en théorie de recopier tous les ARN messager possédant une queue 3' polyA.

Pour la sélection elle peut se faire de pleins de méthodes différentes suivant le type de Banque réalisée

1/ Banque de cDNA dans un vecteur plasmidique classique
Hybridation avec une sonde dite "Spécifique" soit simple soit par comparaison entre deux banques construites avec des cellules traitées différemment
Type de culture.: Avec facteurs de croissance ou sans
infectées ou non infectées
En croissance ou en quiescence
etc......

2/ Banque de cDNA dans un vecteur d'expression bactérien

Les cDNA clonés sont traduits en protéines par expression dans E.Coli et les protéines recombinantes ainsi exprimées sont détectés par
des anticorps mono ou polyclonaux
test enzymatique recherche d'activité de la protéine d'interêt


2/ Banque de cDNA dans un vecteur d'expression eukaryote

La banque est transfecté dans des cellules permettant l'expression des protéines soit à la surface des cellules: Cellules COS par exemple
et la détection/sélection se fait par l'utilisation d'anticorps

la Banque peut également etre transfecté puis la sélection se fait sur la base des critères des cellueles transformées Expression d'un oncogène rendant les cellules immortelles ou poussanrt sur des milieux sélectifs et autres

Bref les possibilitées sont quasi infinies ce qui limite c'est toujoursles critères de sélection


La banque doit normalement contenir au moins un exemplaire de chacun des ARN messager de la cellule étudiée.

Voilà c'est assez complexe mais j'espère avoir été clair !

Pesji

[mimosa]

Merci à tous les deux j'avais compris "en gros" mais il me manquait des détails maintenant c'est beaucoup plus clair!

[Didie13]

•Synthèse d’un ensemble ADNc par transcription inverse:
Transcriptase inverse + dNTPTTTTT 5’
RNAase + ADN polymérase + dNTPTTTTT 5’
Synthèse de l’ADNc double brin

Ok pour la transcription inverse mais à la fin de la transcription, la RNAase H fait son travail et dégrade l'ARN. On se retrouve alors avec un ADNc simple brin.

Comment obtiens-tu un ADNc double brin?

Tu renvoies deux amorces spécifiques et une ADN polymérase?

[titso]

Petits schémas pratiques et explicatifs sur les cDNA...

[nanane21]

Bonjour, j'aurais une question a propos de ce sujet...
Quand on veut cribler une banque d'ADNc avec une sonde ADN marquée, il faut dénaturer avant le vecteur (le plasmide par exemple)???
Sinon je ne vois pas comment la sonde peut s'hybrider..Mais pour dénaturer le plasmide il faut augmenter la température, ça ne tue pas les E. Coli par exemple?
Merci d'avance

[Yoyo]

Bonjour, j'aurais une question a propos de ce sujet...
Quand on veut cribler une banque d'ADNc avec une sonde ADN marquée, il faut dénaturer avant le vecteur (le plasmide par exemple)???
Sinon je ne vois pas comment la sonde peut s'hybrider..Mais pour dénaturer le plasmide il faut augmenter la température, ça ne tue pas les E. Coli par exemple?
Merci d'avance

de toute facon il faut bien casser les cellules d'E. coli pour que ta sonde atteigne l'ADN plasmidique.

YOyo

[nanane21]

Hein, hein...Je n'avais pas vu ça comme ça
Merci pour votre réponse YoYO...
Donc, en fait quand on fait un criblage la banque est détruite. Si l'on veut utiliser le vecteur qui contient l'ADNc d'interrêt il faut re-transfecter des bactéries? Ai-je bien compris?
En cours on nous parle beaucoup de la théorie, aprés pour la pratique, c'est pas trés appronfondi..

[MaliciaR]

Hello,

Donc, en fait quand on fait un criblage la banque est détruite. Si l'on veut utiliser le vecteur qui contient l'ADNc d'interrêt il faut re-transfecter des bactéries? Ai-je bien compris?

On est tous passés par là La pratique avant la L3 (et encore) c'est rare.

Ta banque ne contient pas des cellules : tu te fiches des cellules en gros. Ta banque contient les fragments de ton ADN d'intérêt insérés dans des vecteurs (plasmides, cosmides, YACs, BACs,...). Donc, non, ta banque n'est pas détruite; les cellules portant les vecteurs sont détruites, mais tu le fais dans le but d'extraire ces vecteurs justement Donc, si tu veux utiliser l'ADN contenu, tu peux. Si tu veux l'utiliser pour re-transformer /re-transfecter des bactos, tu peux aussi

Hope that helps


Cordialement,

[nanane21]

je suis en master 1....
J'aurais pu y penser toute seule j'avoue.....Pour moi l'interret c'était d'avoir la bactérie avec le plasmide, et aprés de cultiver cette bazctérie pour multiplier l'ADNc...Mais c'est vrai qu'on peut retransfecter, alors le problème est résolu...
Encore merci!!

[MaliciaR]

je suis en master 1....

Moi aussi Mais tu n'as jamais fait de stages? Vous avez fait des TP, quand même?

J'aurais pu y penser toute seule j'avoue.....Pour moi l'interret c'était d'avoir la bactérie avec le plasmide, et aprés de cultiver cette bazctérie pour multiplier l'ADNc...Mais c'est vrai qu'on peut retransfecter, alors le problème est résolu...
Encore merci!!

Beh, tu introduis dans des bactéries pour obtenir une quantité de plasmides élevée et puis tu extraies cet ADN. Mais le truc est que ta banque n'est pas les cellules, ta banque est toutes les copies des fragments d'intérêt que tu souhaites (représenté chacun une 10aine de fois, je crois, pour être certain que tout le génome est couvert).
Ensuite, une fois que tu as tout ça, tu transformes pour voir des phénotypes associés à des mutations, des sauvetages de phénotypes ou ce que tu cherches De toute façon, tu conserveras ton ADN en tube après son extraction, pas dans des cellules


Cordialement,