Protéine de fusion

[invitea74316c7]

Hello,
Dans le cadre de mon travail de thèse j'étudie l'expression d'une protéine. Pour commencer j'ai donc cloner le cDNA dans un vecteur d'expression pCDNA3 afin de le transfecter dans des HEK. Malheureusement il n'existe qu'un seul type d'anticorps contre cette protéine et le seul qui existe ne fonctionne absolument pas. D'où mon idée de fabriquer une protéine de fusion avec la GFP. Malheureusement je ne sais pas trop comment m'y prendre. Malheureusement je ne trouve aucun site en commun me permettant de simplement digérer puis liguer ma GFP avant le codon stop de la protéine.

Mon idée serait donc de créer des amorces PCR contenant en 5' un site de restriction commun à la séquence de ma protéine et se trouvant le plus proche possible de mon codon stop, et en 3' une partie de la séquence de la GFP afin de pouvoir amplifier la GFP.

Au final je ferai donc une digestion puis ligation de mon insert avec mon vecteur + protéine.

C'est faisable comme ça? Afin de créer ce genre de construction il faut donc que l'ORF de la GFP soit en phase avec l'ORF de ma protéine, correct?
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[mantOs]

Essayes donc le système gateway :

* Fast, one hour, room temperature cloning reactions with >99% efficiency deliver the clone you need
* Maintain orientation and reading frame without using restriction enzymes or ligation makes expression-ready clones
* Eliminate resequencing ensures consistent results throughout your experiment using the same clone from target identification to validation
* Shuttle insert DNA from one expression vector to another affords flexibility while simplifying your cloning workflow

Ce système te permet à partir d'un plasmide "source" de passer ton insert d'un vecteur à un autre assez simplement.

Jette un oeil sur le site pour + de détails.

[invitea74316c7]

C'est malheureusement relativement chpre et donc cela ne passera pas auprès de mon chef. Petite question: la protéine de fusion peut être attachée aussi bien en 5' qu'en 3' ou uniquement en 3'?

[mantOs]

Les TAGs peuvent être en N ou C term. Ensuite il faut pas que le TAG gène la fonction/expression de la protéine.

Personne dans les labos à coté qui ont du gateway pour te preter?

[A voir en vidéo sur Futura]