bruit de fond western blot

[logarithme09]

Bonjour à tous,
Pour certaines protéines, après révélation j'obtiens un bruit de fond énorme sur mes films. Les anticorps viennent de Santa cruz, ce n'est pas forcément tjs de la bonne qualité, mais ceux que j'utilise de santa cruz fonctionnent quand même très bien (p-ERK, ERK, Bactine, PKA...).
Sachant que je laisse incuber l'anticorps primaire 1 nuit à 4°C, et que je fais une dizaine de lavages de 5 min au TBST avant l'anticorps secondaire... Comment puis-je améliorer la technique ?

Voici deux exemples : (bandes presque invisibles, au niveau de la flèche)

phospho PKC epsilon


PKC epsilon


Merci de votre aide !!!!
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[invite30157012]

En effet! Moi je dirais que si dans les mêmes conditions tu as des anticorps qui marchent bien, c'est que cet anticorps est pourri! Essayes-en un autre! (j'ai déjà eu un anticorps de chez santa cruz qui ne détectait rien du tout!)
En tout cas tu as beaucoup de non spé...
Sinon quelques suggestions: 10 lavages ça me parait beaucoup! Moi j'en fais 4 de 10 min, à force de lavages tu risques de diminuer ton signal plus que de l'améliorer. Après quelques membranes assez moches en nitrocellulose, je suis passée depuis bien longtemps au PVDF et perso je préfère j'ai de beaucoup plus jolis blots...
Si je pense à autre chose je te dirais....

Bon courage!

[fabien.che]

Mouais, Santa Cruz et les anticorps... mais ce qui est bien chez eux en général c'est que si l'anticorps ne fonctionne pas tu peux te le faire rembourser ou bien ils t'envoient un autre clone gratuitement.

Tu as essayé de toucher à la saturation ? BSA versus lait par exemple. Une étape de saturation entre le primaire et le secondaire peut aussi éliminer du non spé.

[logarithme09]

En effet! Moi je dirais que si dans les mêmes conditions tu as des anticorps qui marchent bien, c'est que cet anticorps est pourri! Essayes-en un autre! (j'ai déjà eu un anticorps de chez santa cruz qui ne détectait rien du tout!)
En tout cas tu as beaucoup de non spé...
Sinon quelques suggestions: 10 lavages ça me parait beaucoup! Moi j'en fais 4 de 10 min, à force de lavages tu risques de diminuer ton signal plus que de l'améliorer. Après quelques membranes assez moches en nitrocellulose, je suis passée depuis bien longtemps au PVDF et perso je préfère j'ai de beaucoup plus jolis blots...
Si je pense à autre chose je te dirais....

Bon courage!

en fait ça m'étonnerait pas que cet anticorps soit en carton! oui en fait j'ai tendance à vouloir plus laver pour ce genre de films pour éliminer au maximum les anticorps qui essayent de s'accrocher un peu partout mais du coup ça diminue également le signal sur mes bandes... Je vais essayer avec moins de lavages dés demain matin!!! Merci du conseil!
Est-ce que les PVDF c'est pas plus cher ? Parce que c'est quand même la ruine en ce moment dans mon labo

Merci beaucoup pour tous tes conseils )

Mouais, Santa Cruz et les anticorps... mais ce qui est bien chez eux en général c'est que si l'anticorps ne fonctionne pas tu peux te le faire rembourser ou bien ils t'envoient un autre clone gratuitement.

Tu as essayé de toucher à la saturation ? BSA versus lait par exemple. Une étape de saturation entre le primaire et le secondaire peut aussi éliminer du non spé.

Oui mais l'AHU a un peu bloqué sur les santa cruz en disant que Millipore ça vallait rien ! (alors qu'il m'a fait testé que des vieux Anticorps périmés de millipore qu'il nous restait en stock...)! Sans commentaires !
Je vais essayer de tester le BSA mais je pense que ce n'est pas nécessaire entre le primaire et le secondaire car le secondaire est un goat anti-rabbit qui est très spécifique et marchent pour tous les autres anticorps !!!
Merci pour tous les conseils, je vais voir ce que ça donne


Merci
A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite30157012]

Est-ce que les PVDF c'est pas plus cher ?

Non je ne crois pas que ce soit vraiment plus cher, après c'est sûr que si vous n'en avez pas, ce serait peut-être mieux de tester une fois si un autre labo peut t'en prêter avant d'en commander.
La seule contrainte c'est qu'il faut mouiller la membrane dans du méthanol avant le transfert. Mais sinon moi je n'utilise plus que ça!

[logarithme09]

Non je ne crois pas que ce soit vraiment plus cher, après c'est sûr que si vous n'en avez pas, ce serait peut-être mieux de tester une fois si un autre labo peut t'en prêter avant d'en commander.
La seule contrainte c'est qu'il faut mouiller la membrane dans du méthanol avant le transfert. Mais sinon moi je n'utilise plus que ça!

Désolée en fait je viens de me rendre compte que les membranes que j'utilise sont bien des PVDF et non de la nitrocellulose !!!! Effectivement ça donne de bons résultats, sauf avec ces 2 anticorps de m... lol!
Merci Delphinette

[fabien.che]

La seule contrainte c'est qu'il faut mouiller la membrane dans du méthanol avant le transfert.

Juste par curiosité, l'éthanol ne suffit pas ? Parce que bon, le méthanol...

[logarithme09]

Juste par curiosité, l'éthanol ne suffit pas ? Parce que bon, le méthanol...

Je sais que nous on réutilise le méthanol dans lequel on a trempé la membrane car apparemment on a pas le choix d'utiliser du méthanol par contre pour le tampon de transfert, on peut utiliser de l'éthanol à la place du méthanol !!!

[LXR]

Le méthanol a une meilleure mouillabilité que l'éthanol qui est plus sec. Effectivement on peut remplacer le méthanol par l'éthanol mais j'ai pu observer un transfert moins efficace avec l'éthanol, dans mes conditions.

[invite30157012]

Je confirme, méthanol pour mouiller la membrane c'est mieux, il suffit de tremper dans quelques ml sous la sorbonne, 30 sec juste histoire de mouiller la membrane, rien de si contraignant...! Ensuite on peut la mettre à équilibrer dans le tampon de transfert pour lequel on utilise de l'éthanol.