gel ADN stress

lola10395 · 14/06/2011 - 16h01

bonjour tout le monde

je voudrai savoir si les stress que l'on applique in vitro influent sur la quantité de l'ADN ou pas.
ces ADN sont extraient de feuilles auxquelles j'ai appliqué un stress à différents niveaux; j'ai obtenu des bandes au même niveau; c à d de même taille ; mais la quantité diffère
parfois chez le témoin la quantité est importante pour une variété X ; dans d'autres c'est chez les stressés niveau 1 pour la variété Y; et dans d'autres puis c'est le niveau 2 de stress (pour une variété Z) qui a la quantité d'ADN la plus élevée.
je n'arrive vraiment pas à interpréter ce gel

aidez moi

YouLab · 14/06/2011 - 19h34

Oui c'est possible si le stress devient très fort et bousille l'ADN.

Laeti06 · 15/06/2011 - 09h03

Dans ton cas, je ne dirai pas que c'est le stress qui est entièrement responsable du résultat. Il y a beaucoup de paramètres qui peuvent expliquer ces différences de quantité après PCR (qualité des explants choisis pour l'extraction, qualité de l'extraction, PCR et réactifs capricieux, emplacement dans le thermocycleur...)

En revanche, une hypothèse serait de dire que si le stress est effectivement très fort, de nombreuses cellules mourront et l'ADN sera peut-être un peu endommagé (ex : stress hydrique entraînant le dessèchement des feuilles...). Quoi qu'il en soit moi je ne m'aventurerai pas à donner une conclusion nette mais plutôt à lister une série d'hypothèses pouvan expliquer le résultat.

NB (et à garder en tête): quand on fait une PCR classique, l'intensité des bandes reflètent en général la quantité d'ADN amplifié mais ce n'est pas strictement vrai et il ne faut pas conclure qu'on a plus ou moins d'ADN.
Cette conclusion ne peut être strictement vraie que dans le cas où tu fais une PCR quantitative.

YouLab · 15/06/2011 - 09h53

Ca dépend du fluorescent utilisé pour la révélation aussi, tu utilise quoi?

jmbowie · 15/06/2011 - 10h51

Envoyé par YouLab

Oui c'est possible si le stress devient très fort et bousille l'ADN.

ou si cela joue sur la topologie de tes plasmides par exemple

lola10395 · 15/06/2011 - 17h36

bonjour
merci de me répondre
pour le fluorescent c'est le BET bromure d'éthidium ; mais je dois vous dire que pour l'instant je n'est pas encore fait de PCR ; juste une électrophorèse d'ADN ; je vais quantifier mon ADN juste pour savoir si il est pure ou pas ; mais la PCR je ne dispose pas encore d’amorces
le but c'est de vérifier si le stress a un effet sur la quantité d'ADN ou pas mais c'est les résultats que j'ai obtenus qui ne sont pas claire ;
en plus je ne pense pas parler de stress sévère puisqu'il n'y a pas de nécroses ou de jaunissement
merci d'avance

YouLab · 15/06/2011 - 18h01

Ah oui le BET c'est pas top pour la quantification. Mais je suis étonné, il y a encore des gens qui bossent au BET en 2011?

Laeti06 · 16/06/2011 - 07h14

Envoyé par YouLab

Ah oui le BET c'est pas top pour la quantification. Mais je suis étonné, il y a encore des gens qui bossent au BET en 2011?

Et oui.... Et croyez-moi, certains labos ne sont pas bien au courant des principes de précautions les plus élémentaires.

En ce qui concerne la question de lola j'ai tiqué sur ça : "le but c'est de vérifier si le stress a un effet sur la quantité d'ADN ou pas"
Comment répondre à cette question sans PCR quantitative ?? Il s'agit d'un TP ? D'un stage ?
Bref, ça me laisse un peu perplexe...

lola10395 · 16/06/2011 - 18h10

bonjour
oui on travail encore avec le BET et on sait qu'il est cancérigène mais on prend des précautions
il s'agit d'un stage qui entre dans le cadre de mon mémoire de licence (physiologie végétale)

YouLab · 16/06/2011 - 18h41

Je vous conseille de passer à des englobants qui sont moins toxiques, du genre gel red.

Laeti06 · 17/06/2011 - 07h24

Envoyé par YouLab

Je vous conseille de passer à des englobants qui sont moins toxiques, du genre gel red.

Dans le labo dans lequel je travaille, il est hors de question de passer au gel red. 1) Trop cher par rapport au BET, 2) si on est conscient du danger, on se protège en conséquence et donc y a pas de risque, 3) la sensibilité du gel red n'égale pas celle du BET.
Bref, dur dur de changer les mentalités.

Pour ce qui est du sujet, lola10395, n'as-tu pas la possibilité de quantifier ton ADN à l'aide d'un spectrophotomètre UV (genre Nanoview ?) Ce sera plus précis et tu t'épargneras sûrement les questions de sensibilité du BET, de gel qui peut refroidir trop vite et donner des bandes pas très jolies (je parle d'expérience...)

lola10395 · 17/06/2011 - 13h10

bonjour
la probléme est non pas de quantifier mon ADN car mais juste d’interpréter le gel surtout que je ne dispose pas de spectro
seulement c'est pourquoi obtient on des bandes pas très intense avec le témoin et des bandes bien intense avec les stressés et parfois chez d'autres variétés c'est l'inverse
merci d'avance