Rt-pcr

[invite4ce6d8f6]

Bonjour à tous,

Je fais de la RT-PCR sur des d'ARN extraits à partir de poumons. Je réalise une extraction au trizol puis sur colonne d'affinité pour purifier mes ARN. Pas de contaminations protéiques, et des ARN de qualité. je réalise ensuite une DNAse avant RT-PCR sur 250ng d'ARN... jusqu'ici tout va bien. Le problème est qu'après PCR, j’obtiens un signal intense et non spécifique à environ 100pb, quelque soit la PCR que je réalise.

Est ce que quelqu'un a déjà eu ce problème? comment y remédier?

Merci par avance
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[kamor]

En bas de gel, je dirais des ARN ribosomiques. Comment y remédier... je sais ça a été très souvent ce que je cherchais

[jugen]

Bonjour,

A mon avis ton signal correspond à tes amorces non hybridées. Elles apparaissent souvent sur le gel quand elles sont en excès dans la réaction (elles peuvent former des dimères entre elles). En baissant leur quantité tu devrais avoir un signal moins fort.

Pour être sûr il me faudrait une photo de ton gel pour voir si c'est bien ce que je pense.

[invite4ce6d8f6]

le problème est que j'amplifie rien du tout que ce soit pour le 28S ou TNFalpha, j'ai toujours cette "patate" au alentour de 100pb. c'est vrai que ça pourrait être des amorces non hybridées, mais dans ce cas ne devrais-je pas avoir quand même mes produit de PCR? (je vous envoie ma photo) Merci bcp en tout cas de votre aide!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite4ce6d8f6]

Par contre je suis novice sur ce forum, comment faire pour joindre un fichier?

[Flyingbike]

si tu fais répondre en mode avancé, il y a une icône avec un trombone. C'est là.

[invite4ce6d8f6]

Merci bcp

[invite4ce6d8f6]

Voici la bête!

[Flyingbike]

il faudrait que tu fasses un contrôle négatif de RT (par exemple un échantillon sans reverse transcriptase) et ensuite plusieurs contrôles négatifs de PCR (un sans template, un sans enzyme et un sans amorces).
Comme ça on pourra vraiment savoir d'où ça vient.
Vu comme ça on dirait quelque chose de dégradé.

COmment vérifies-tu tes ARN (gel, puce, etc ?)
Quel est ton protocole de RT ?
Comment la DNase est inactivée ?

[Flyingbike]

[edit]
je viens de regarder dans mon cahier de labo, quand j'ai des ARN dégradés ça me fait le même profil vers 100pb
[/edit]

[invite4ce6d8f6]

D'accord, je suis en train d'en relancer une d'autre échantillons, pour voir si ce problème ne vient pas de mon extraction, la RT est en train de tourner, je vais faire plusieurs contrôle négatif sur la PCR! pour verifier la qualité de mes ARN je fais simplement un gel d'agarose pour voir l'état des ARN ribosomaux. Pour la RT, j'utilise un quitte deja utilisé au lab, qui est enfaite un kit de RT-qPCR (invitrogen) le mix pour un ech : 10µl de TP, 2µl de RT, 5.25µl d'eau DEPC sur 250ng d'ARN (qui subit précédemment un étape DNAse, préconisée par le kit)

[Flyingbike]

A y réfléchir ca ressemble vraiment a des ARN dégradés. Donc : est tu sure de tes ARN avant la réaction ? As tu accès a un inhibiteur de RNase genre "RNAsin" ou "RNAse Out" ?

[invite4ce6d8f6]

oui j'ai accès à une RNAse out. je lance la manip demain matin. je pensais aussi au faite que l'étape DNAse (avant RT) se fait 15 min à T°C amb. Est ce que cela n'influencerait pas la dégradation de mes ARN?

[jugen]

Alors en effet ça à l'air d'être des ARN dégradés. Tes ARN tu les vérifies avant ou après le traitement DNAse ? moi j'avais l'habitude de faire les 2 pour être sûr de la qualité.

[invite4ce6d8f6]

oui je fais les deux aussi, j'ai pas non plus des superbe ARN, on voit qu'il y a un peu de dégradation, mais pas énorme non plus. j'ai le kit RNAseOUT recombinant Ribonuclease Inhibitor de chez invitrogen, mais aucune concentratio d'utilisation n'est indiquée, et les publication de reference sur le site d'invitrogen indique des mode d'utilisation completement différents! du genre la RNAse out est ajoutée avec la RT, ou d'autres indiques RNAse out + DNAse... comment utilisez vous cette enzyme?

[jugen]

Alors par expérience je sais qu'une fois que le processus de dégradation des ARN a été enclenché ils se dégradent très rapidement.
C'est de l'ARN humain ? Je te demande ça car moi je suis amené à travailler autant sur des plantes que sur de l'humain et nous avons pu remarquer que les échantillons humain sont beaucoup plus fragile.
Après si tu as vu que tes ARN sont un peu plus dégradés après traitement DNAse je te conseillerai d'essayer de mettre la RNAse out avec ça limiterait peut-être la casse mais je ne l'ai jamais fait.

[invite4ce6d8f6]

Il s'agit d'ARN murins. ET oui, en effet, j'avais l'impression qu'ils été plus dégradés après traitement DNAse... je test donc la RNAse out avant de faire la DNAse demain matin! j'espère que le problème vient de là! je vous remercie pour vos conseils et vous tiens au courant des résultats!
Merci beaucoup
Bonne fin de journée

[jmbowie]

Profil typique d'ARN dégradés, ce que l'on peut observer après une PCR sur ARN même si ceux-ci ne le sont pas au moment de la réaction.
Bon courage anyway

[Flyingbike]

quel type de colonnes utilises tu ?

si les ARN sont susceptibles de dégradation, ce que je fais c'est mettre 1µl de RNAsin dans un tube vide, puis d'éluer les ARN de ma colonne dans ce tube. Bien agiter.

Tu peux en ajouter aussi 1µL ou 0,5µL dans la réaction de RT. En effet, les ARN ont l'air stables avant la réaction, mais tout peut se passer au moment ou tu dénatures des ARN avant la RT. Ca devrait les protéger.

[invite4ce6d8f6]

j'utilise une colonne de chez sigma qui s'appel GenElute Mammalian total RNA miniprep kit, c'est une colonne avec une membrane de silice. SI je fais la RNAse out avant de faire ma DNAse et ma RT, sa marche aussi? je peux la faire quand je veux enfaite? dans les publications j'ai trouvé que certains faisaient cette étape pen même temps que la RT, d'autre en même temps que la DNAse... Moi je l'ais fais avant la DNAse, directement sur 1µg d'ARN...

[Flyingbike]

normalement tu dois pouvoir faire la DNAse sur la colonne directement. ensuite tu laves la colonne avec un tampon de rinçage et tu élues dans un peu de RNAsin. Regarde dans le protocole de sigma.
Tu n'as pás répondu par rapport à l'inactivation de la DNase ?

[invite4ce6d8f6]

Dsl je n'avais pas vu cette question, j'inactive ma DNAse avec 1µl d'EDTA 25mM, 10min à 65°C.
et en effet, après une lecture attentive du protocole du kit, ils disent que l'on peux ajouter un mix "solution de lavage-DNAse" directement sur la colonne...
Par contre, ils ne parle à aucun moment de RNAse out/in puisqu'ils considère que le trizol permet d'inactiver les RNAse...

[invite4ce6d8f6]

Est ce que vous pensez que le faite que je fasse ma DNAse après la purification sur colonne pourrait affecter l'état de mes ARN?
De plus, je viens de lire que la DNAse ne doit pas être vortex, chose que je faisais...

[Flyingbike]

je ne sais pas du tout. En effet la DNAse est fragile, ne pas vortexer.

Ce que je conseille pour avoir des ARN irréprochables :
suivre le protocole de sigma
effectuer DNAse sur colonne selon protocole
Eluer dans un peu de RNAsin
Au moment de la RT lors de la dilution des ARN, ajouter 0,5µL d'inhibiteur par tube

[kamor]

Le vortex est quelque chose à déconseiller avec toute enzyme, ça a tendance à les destructurer donc annuler leur activité par perte de leur structure tertiaire (voire quaternaire)

[invite4ce6d8f6]

ok, je prends note

[Flyingbike]

l'avantage de cette méthode c'est que tu te débarasses de la DNAse (pas besoin d'inactiver)

[invite4ce6d8f6]

oui s'est vrai que sa me parait plus judicieux de faire ainsi. Merci beaucoup en tout cas, c'est vraiment sympa de pouvoir communiquer et trouver des réponses à ces problèmes techniques!

[invite4ce6d8f6]

Bon, même en présence d'RNAse out, toujours le même profil... je n’ai plus d'idées quant à l'origine de ce problème! quand je test sur des échantillons déjà extrait et purifié, je n'est pas d'amplification du 28S, mais j'ai plus c'est patates!! quelqu'un a une autre idée... svp je suis à bout de nerf

[jugen]

ça peut venir de tes amorces si tu n'as pas d'amplification avec d'autres échantillons de bonne qualité, elles ne sont peut-être pas spécifiques de ton 28S.