Bonjour à tous!
Est-ce que quelqu'un connait mieux (ou peut me suggérer des références) concernant la perte spontanée d'insert lors du clonage? Par quelle méchanisme au sein de la bactérie? sous quelles conditions? Comment on peut l'éviter?
Merci d'avance,
Bonjour,
Il ne faut surtout pas oublier qu'une bactérie reste un organisme vivant et non une usine de production, et par conséquent on peut avoir des surprises quant au plasmide qu'on y insert !
Pour les "inserts difficiles", ce que je conseille, c'est d'éviter de trop faire pousser les bactéries, plutôt privilégier un culture à faible température sans faire exploser la DO, quitte à cumuler plusieurs cultures pour avoir un culot conséquent.
Merci Malesore pour ta réponse,
En fait, j'ai fait un clonage : j'ai essayé d'inserer un gène (2,5kb) dans un plasmide (10kb, pCambia 1300), en aval d'un promoteur (qui lui est déjà préalablement inséré dans le même plamide). Mais comme je travail sur un même site (SacI), j'ai réussi (après beaucoup de galère) à avoir une clone positive mais avec mon insert inversé (criblé par pcr et vérifié par digestion). J'ai alors redigéré les plasmides venant de cette clone et refaire la ligation. Sur 40 colonies, j'ai eu 6 qui ont mon insert dans le bon sens (d'après le pcr) sauf que si je fait le miniprep à partir de ces colonies je me retrouve finalement avec des plasmides vides (c'est à dire sans mon insert). Je refait le manip (dépuis le pcr des colonies positifs, avec comme controle le plasmide vide) pour confirmer que je me suis pas trompé de colonies mais ça donne toujours la même chose. Donc je commence à penser que les bactéries rejettes mon insert et seulement quand celui-ci est dans le sens que je veux. Je voudrais alors savoir alors si dans mon cas mon hypothèse est probable? Je veux savoir plus aussi comment les bactéries rejettent un insert qui est déjà ligué au sein du plamide?
Sinon, j'ai déjà relancé des cultures avec les colonies et les laisser seulement incubé pendant 6h (200rpm, 37°C) pour voir si j'aurai mon plasmide+insert après.
Par ailleurs, c'est la première fois que j'ai eu ce problème (d'habitude, je laisse ma culture de bactérie pousser entre 12 et 16h avant de faire le prep)
Merci d'avances pour vos suggéstions,
es tu sur de tes pcr ?
fais tu un contrôle négatif plasmide seul dans tes pcr ?
fais tu une transformation contrôle plasmide seul ?
ton clonage n'est pas orienté ?
si tu fais migrer tes preps, quelle est la taille obtenue ?
Oui à chaque fois que je fait le criblage, je fait toujours un contrôle négatif plasmide seul et qui me donne aucune bande (comme j'utilise un amorce dans le plasmide et un autre dans mon insert).
Justement, mon clonage n'est pas orienté.
Alors pour la taille, si je fait migrer sur gel (désolé pour la précision):
- le plasmide vide = entre 10 et 20kb
- le plasmide avec l'insert inversé = entre 10 et 20kb
- plasmide avec l'insert inversé mais digéré pour faire sortir l'insert = environ 10kb
- plasmide sensé avoir inseré mon fragment dans le bon sens (ce qui est en réalité après vérification par pcr et par digestion ne contenant pas du tout mon insert) = entre 10 et 20kb
-plasmide sensé avoir inseré mon fragment dans le bon sens et digéré avec sacI lors de la vérification = toujour entre 10 et 20kb mais un peu derrière du même plasmide non digéré (ceci est valable pour toutes les 4 clones)
J'ai déjà séquencé 2 de ces colonies mais ils sont toutes 2 vides.
Merci
pour résumer, tu sais que tu as l'insert par PCR mais tu ne le sors pas en miniprep.
A partir de quoi fais tu tes PCR de criblage ? bactéries entières ?
tu es sur que l'insert que tu sors de ton clone positif avant le reclonage est correct ? pourquoi repartir d'une digestion d'une insertion inversée ?
il y a une question a laquelle tu n'as pas répondu : quand tu fais ta transfo, fais tu une boite avec le plasmide seul digéré ?
fais tu une déphosphoration avant ligation ?
Oui j'ai l'insert par PCR avec les bactéries entières mais je l'ai pas par miniprep (pcr ou digestion).
Je suis presque sûr que l'insert est correcte puisque la taille est bonne et que mon control négatif (plasmide vide et clone négatif) ne me donne rien.
En fait, je part du plasmide avec l'insert inversé puisque c'est la seule colonie positive que j'ai eu (Etant donné que je suis sur ce clonage depuis plus de 3 mois). Je religue directement après. Evidemment, j'ai eu beaucoup de background.
En parallèle, j'ai essayé de récupérer mon insert inversé sur gel et de le liguer avec mon plasmide digéré et déphosphorylé mais ça ne m'as rien donné comme colonies.
Ce n'est pas surprenant en soi !
Si Coli n'aime pas ce que tu lui injectes, elle va le rejeter ...
Je me suis retrouvé dans ce cas dernièrement. Dans ma midiprep, je me suis retrouvé avec deux populations de plasmides qui différaient de 15 pb .. Coli avait tout simplement décidé de faire sauté un morceau de mon insert d'origine. Du coup, dans ma culture, je me suis retrouvé avec deux populations de bactéries ...
Dans ton cas, c'est peut être le même problème à plus grande échelle. Si Coli "n'aime pas" ton insert, elle va le rejeter ... Donc, ce que je peux conseille déjà, si tu es vraiment sur que ton plasmide est bien construit à la base, c'est de changer tes conditions de culture pour éviter le rejet du plasmide par la bactérie (si c'est vraiment ça le problème ...). Diminues la température de culture à 30°C et stoppe la culture quand tu es à DO 0.5 ... Dans un environnement moins stressant, la croissance bactérienne serait certes plus lente, mais tu évites ce genre de rejet ...
Merci Malesore,
J'ai déjà fait pousser pendant 6h à 37°C (voir mon message avant) et ça m'a donné rien.
Maintenant, je vais essayer de faire pousser à 30°C comme tu m'as dit.
Il faut surtout jouer sur la température et le volume d'incubation. Il faut éviter que la culture soit à une DO trop forte. Donc diminuer la température et augmenter le volume de culture ainsi que le temps d'incubation peuvent aider
