hybridation adn/adn : technique de southern blot

[invite899e9223]

Bonjour tout le monde.
Je vous expose mon problème, en espérant que quelqu'un voudra bien m'aider à trouver une solution.
j'ai réalisé récemment une hybridation adn/adn par la technique de Southern blot. Lors de la digestion enzymatique, il à été utilisé de l'ADN provenant de phage lambda. Les différents tubes comportaient également de l'eau stérile, du tampon 10X, Ainsi que les enzymes de restriction, (EcoRI et/ou HindIII selon le tube) . Ensuite, j'ai effectué une électrophorèse en gel d'agarose à 1%. la migration à duré 1heure environ, à 120volts. Le problème qui se pose est qu'à l'issue de la migration, les fragments des différents puits ont très peu migrés, puisqu'à peine 3 ou 4 bandes sont visibles en haut du gel. De plus, une longue trainée très fine est visible entre le puit, et la première bande visible. Donc j'ai émis plusieurs hypothèses.
- temps de migration trop court, mais une migration de mon marqueur jusqu'en bas du gel semble contredire cela
- digestion incomplète, ou absence d'enzyme, mais dans ce cas, je me dis qu'on observerait de gros "patés" en haut du gel.
- contaminaton des échantillons (je précise que les cones n'ont pas été changés), mais je ne vois pas en quoi cela expliquerait la faible migration. A moins que dans ce cas là, la présence simultanée de plusieurs enzymes aurait engendré des fragments vraiments minuscules, ce qui expliquerait que ceux ci soit sortis du gel.
Donc si quelqu'un avait une petite idée pour expliquer:
-la faible migration des bandes
-la longue trainée horizontale présente entre le puit et la 1ère bande.
merci d'avance. Toute suggestion me sera utile. J'avoue je suis complètement perdue là.
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[kamor]

Bonjour tout le monde.
Je vous expose mon problème, en espérant que quelqu'un voudra bien m'aider à trouver une solution.
j'ai réalisé récemment une hybridation adn/adn par la technique de Southern blot. Lors de la digestion enzymatique, il à été utilisé de l'ADN provenant de phage lambda. Les différents tubes comportaient également de l'eau stérile, du tampon 10X, Ainsi que les enzymes de restriction, (EcoRI et/ou HindIII selon le tube) . Ensuite, j'ai effectué une électrophorèse en gel d'agarose à 1%. la migration à duré 1heure environ, à 120volts. Le problème qui se pose est qu'à l'issue de la migration, les fragments des différents puits ont très peu migrés, puisqu'à peine 3 ou 4 bandes sont visibles en haut du gel. De plus, une longue trainée très fine est visible entre le puit, et la première bande visible. Donc j'ai émis plusieurs hypothèses.

Ca serait quand même plus simple si tu pouvais poster la photo de ton gel

- temps de migration trop court, mais une migration de mon marqueur jusqu'en bas du gel semble contredire cela

Si tes bandes ne "descendent pas", c'est peut être aussi parce que tes fragments sont trop gros. Il faudrait essayer un gel moins concentré
[quote]- digestion incomplète, ou absence d'enzyme, mais dans ce cas, je me dis qu'on observerait de gros "patés" en haut du gel. [quote]
Tu vois un smear donc de l'ADN dégradé. Peut être une contamination de DNase.

- contaminaton des échantillons (je précise que les cones n'ont pas été changés), mais je ne vois pas en quoi cela expliquerait la faible migration. A moins que dans ce cas là, la présence simultanée de plusieurs enzymes aurait engendré des fragments vraiments minuscules, ce qui expliquerait que ceux ci soit sortis du gel.

Peut être par une DNase. Par de l'ADN tu obtiendras en gros la même chose

[invite899e9223]

Bonjour, je te remercie beaucoup pour ta réponse Kamor.
Je vais donc poster la photo de mon gel comme tu l'as suggéré.
Le contenu des puits de gauche à droite est le suivant:
- EcoRI
-HindIII
-EcoRI + HindIII
-ADN Lambda
-Marqueur
Par contre je n'ai pas bien compris le rôle du tampon 10x. S'agit-il bien d'un tampon permettant l'activation de l'enzyme en question? Dans ce cas, une quantité insuffisante de ce tampon expliquerait - il une digestion incomplète de l'enzyme, d'où le fait que j'obtienne des fragments trop gros restant coincés en haut du gel comme tu l'as dit?
D'ailleurs je constate que le puit 2 est identique au puit 4 contenant l'ADN, ce qui signifirait que l' ADN est resté intacte et n'as donc pas été digéré.

[invite899e9223]

Personne d'autre pour m'aider s'il vous plait? je suis ouverte à toute proposition

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite899e9223]

Sinon j'ai un autre gros problème là. je suis complètement perdue. j'ai beau réfléchir et je ne vois pas de solution.
Mon ADN lambda à un poids moléculaire de 48 502 pb. Et le premier fragment de mon marqueur correspond à 21 226 pb. Or en regardant mon gel, je constate que mon ADN lambda( puit n°4) à migré au meme niveau que le premier fragment du marqueur! comment peut- on expliquer cela puisqu'ils n'ont pas le même poids moléculaire?
Donc dans ce cas, le fragment d'ADN visible au puit 4 à déjà été digéré! puisqu'en regardant ma carte de restriction, je constate que EcoRI permet d'obtenir un fragment de 21 226 pb. Pourtant mon puit 4 ne contient pas d'enzyme, donc pas de digestion possible. donc je ne n'arrive pas à comprendre pourquoi les 2 bandes sont au même niveau.
Si quelqu'un veut bien m'aider à comprendre cela, je lui en serai très reconnaissante, parce que je bloque vraiment là dessus. Merci d'avance.