Clonage avec plasmide

[invite463d5100]

Bonsoir,
J'ai une question en ce qui concerne le clonage avec un plasmide, j'ai cru comprendre quelques trucs mais j'ai peur de m'embrouiller avec la PCR en ce qui concerne les enzymes de restriction.
Voilà ce que je crois comprendre :

En premier il faut séquencer le génome pour obtenir les différents fragments d'un gène dont un codant pour la protéine qui nous intéresse et on veut cloner ce gène.

on met les différents fragment dans un plasmide, et c'est là que rentre en jeu les enzymes de restriction, donc quand on dit que le plasmide a un site de restriction BamH1 cela veut dire que c'est cette enzyme BamH1 qui va cliver un bout du fragment du gène ?

Ensuite on met ces plasmides dans des bactéries dans un milieu avec de l'ampicilline pour voir lesquelles résistent et donc lesquelles portent la protéine qui nous intéresse.

je crois que je confonds les sites de restriction présent sur le plasmide et les enzymes de restriction que l'on ajoute aux amorces pour faire la PCR.

j'ai un exercice ou il faut donner le protocole de clonage mais c'est tellement flou pour moi que j'ai du mal à y répondre.

Le problème c'est que je comprends comment "faire" les amorces mais je ne comprends pas trop à quoi elles servent

Je vous remercie d'avance pour vos réponses et je vous souhaite une bonne soirée d'haloween (la mienne sera sous le signe de la biologie moléculaire!)
-----

[invite463d5100]

s'il vous plait j'ai un partiel dans pas longtemps...

[nowell]

Bonjour,

Les sites de restrictions sont en fait des séquences consensus dites palindromiques qui sont donc identiques dans le sens 3'-5' et 5'-3'. Ces séquences soont reconnues par des enzymes particulières très souvent d'origine bactériennes (EcoR1, EcoR5, BamH1...).
Elles permettent notamment en génie des vecteurs, d'ouvrir un plasmide, et d'y insérer un gène YFG dont les extrémités sont construites pour etre complémentaires avec le site de restriction pour que cela colle pile poil.

En générale YFG est couplé à un gène rapporteur (qui permet la sélection des plasmides qui intègrent effectivement YFG). C'est souvent un gène de résistance chez les bactéries. Ainsi lorsqu'on place les bactéries qui ont intégré le plasmide dans un milieu avec antibiotique, ce sont celles qui survivent qui on intégré YFG étant couplé audit gène de résistance à l'antibio.

[Pour une PCR, on ajouter parfois des enzymes de restriction pour cliver l'adn, selon exactement le même principe décrit ci-dessus, il n'y a simplement pas d'insert de gène, donc pas de source de confusion any more normalement^^]

Quant aux amorces, vous devez faire allusion à la PCR cette fois-ci... je pense
Les amorces sont des oligonucléotides (en général environ 20nt), qui permettent d'encadrer sur les deux brins 5'3' et 3'5' la séquence que l'on veut amplifier. Ce sont donc des amorces qui permettent de donner un substrat de base à partir du quel les polymérases penvent continuer à générer des brins complémentaires d'amplification.

Vous devriez maintenant y voir un peu plus clair je pense. sinon je reste à votre dispo, après le boulot ce soir par contre ^^, et puis il y a 200 autres personnes qui peuvent reprendre et approfondir cela aussi.

Cordialement
Nowell

[invite5ff7e353]

salut

Ensuite on met ces plasmides dans des bactéries dans un milieu avec de l'ampicilline pour voir lesquelles résistent et donc lesquelles portent la protéine qui nous intéresse.

petit détail, la sélection des bactéries par l'ampicilline sert à savoir si la bactérie possède le plasmide, mais cela ne donne pas d'indication si le gène codant la protéine a bien été inséré dans ce vecteur

pour le protocole de clonage, la première étape est la création d'une banque d'adn (extraction adn, digestion par une enzyme de restriction puis ligation de ces fragments dans des plasmides portant les sites de restrictions de l'enzyme restriction choisie). Ensuite il faut insérer tout les plasmides dans une bactérie lambda, effectuer une transformation bactérienne pour rendre la protéine native inefficace. Puis la bactérie portant le bon plasmide est sélectionnée parmi toutes les autres sur un milieu nécessitant la protéine d'intérêt (or le gène natif ayant été muté, la protéine ne pourra provenir que du plasmide)

voilà, j'ai pas répondu à tous, mais j'espère que sa t'aideras

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Bonjour,

en bleu mes commentaires. Bon courage.

Bonsoir,
J'ai une question en ce qui concerne le clonage avec un plasmide,
On ne clone pas avec un plasmide mais dans un plasmide. Cloner, c'est le fait de reproduire à l'identique quelque chose. Un clone, c'est l'ensemble des éléments identiques (deux jumeaux forment un clone). Ainsi pour cloner de l'ADN, on l'insert dans un vecteur (dans votre cas un plasmide) et on amplifie la quantité de vecteur.

il faut séquencer le génome pour obtenir les différents fragments d'un gène dont un codant pour la protéine qui nous intéresse et on veut cloner ce gène.
Séquencer ne donne pas physiquement le fragment. Il faut que vous ayez déjà le ou les fragments pour pouvoir les séquencer (littéralement: en connaître la séquence, l'enchainement des acides nucléiques qui les composent)

on met (on insert) les différents fragment dans un plasmide, et c'est là que rentre en jeu les enzymes de restriction, donc quand on dit que le plasmide a un site de restriction BamH1 cela veut dire que c'est cette enzyme BamH1 qui va cliver un bout du fragment du gène ?
Voir ce qui vous a déjà été répondu.

Ensuite on met ces plasmides dans des bactéries dans un milieu avec de l'ampicilline pour voir lesquelles résistent et donc lesquelles portent la protéine qui nous intéresse.
Pas nécessairement de l'ampicilline. Le choix du marqueur de sélection dépend du plasmide que vous utilisez. Le plus courant est que ce plasmide contient un gène de résistance à l'ampicilline. Quand vous transformez votre bactérie avec votre plasmide, ce dernier lui confère la résistance à l'ampicilline. Ainsi, en ajoutant de l'ampicilline au milieu, seules celles avec un vecteur survivent. Vous sélectionnez les bactéries transformées, pas nécessairement celles qui contiennent votre fragment d'ADN d'intérêt.

je crois que je confonds les sites de restriction présent sur le plasmide et les enzymes de restriction que l'on ajoute aux amorces pour faire la PCR.
Ce sont les mêmes! Si vous souhaitez cloner dans le site BamHI d'un vecteur et que votre fragment d'ADN ne porte pas de site BamHI, vous allez créer des amorces PCR contenant NNNNNN-BamHI-extrémité5'dufragment et NNNNNN-BamHI-extrémité3'dufragment (antisens) Votre fragment amplifié sera NNNNNN-BamHI-fragment-BamHI-NNNNNN et vous pourrez générer votre fragment avec des extrémités BamHI libres qui pourront liguer avec celles de votre vecteur.
j'ai un exercice ou il faut donner le protocole de clonage mais c'est tellement flou pour moi que j'ai du mal à y répondre.

Le problème c'est que je comprends comment "faire" les amorces mais je ne comprends pas trop à quoi elles servent
1. identifier votre fragment (si l'organisme a déjà été séquencé, voir la carte de restriction et repérer les sites de restrictions absents du fragment)
2. voir quels sites de restriction sont intéressants dans votre plasmide
3. Trouver un site de restriction intéressant dans le plasmide qui soit absent du fragment d'ADN à cloner
4. Créer les amorces de PCR telles que je vous les ai indiquées plus haut
5. faire la PCR
6. Digestion de restriction de la PCR et du fragment
7. ligation des vecteurs et des fragments digérés
8. transformation des bactéries et culture sur boite
9. identification des colonies de bactéries transformées
10. purification des clones
11. séquencage et sélection des clones.

Bon, ceci n'est pas vraiment un protocole, juste une ligne directrice. Il manque l'ensemble des étapes de contrôle et des précisions ici ou là.

Cordialement,
piwi

[invite463d5100]

Je vous remercie pour vos réponses j'ai un peu mieux compris grâce à vous ^^

Une derniere question piwi je ne comprends pas ce que veut dire : Digestion de restriction de la PCR et du fragment dans l'étape 6

désolée c'est peut etre des questions betes mais je suis issue de médecine j'ai attéri direct en L2 et j'ai jamais fait de truc comme ça donc j'ai un peu de mal

merci encore pour vos réponses!

[piwi]

Pardon, c'est de la PCR (le fragment) et du vecteur (plasmide dans votre cas).

piwi

[invite463d5100]

merci beaucoup!