Aide pour culture en boite de Pétri de cellules type cellules d'oignons.

[Wandrill3]

Bonjour,

Je requiert votre aide pour de la culture cellulaire.
Je desirerai cultiver des cellules comme les cellules d'épidermes d'oignons (cellules ou l'on distingue facilement le noyau du cytoplasme à un grossisement microscopique faible) dans des boites de Pétri.
Le problème, c'est que je ne suis qu'en 1ere, je n'ai quasiment aucun matériel pouvant me permettre de faire du filtrage de cellule etc ...
J'ai à mes dispositions, des boites de Pétri, une armoire de culture in-vitro, des pipettes pasteurs, un milieu gélosé Agar agar et/ou Sabouraud.
Mes professeurs sont intéressés par les recherches que je fais mais completement dépassé lorsque je leur demande de l'aide précise.
Il me faut des cellules ne nécessitant pas trop d'entretient et de produit nutritif précis, qui aurait un cycle cellulaire inférieur à 30 minutes en se divisant par mitose et qui aurait une forme ressemblant à celle des cellules d'oignons (forme rectangulaire). Enfin, les cellules doivent être un minimum connu et que je puisse trouver sur des sites comme NCBI.org des protéines la composant.

J'ai contacté une Université, mais cette dernière m'a tout simplement qu'en étant en 1ere, je n'avais pas a connaitre de telles procédés ...

Je vous remercie d'avance pour toutes vos réponses !
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[invite144f2661]

Bonjour,
la culture de cellules est très complexe et nécessite des milieux spécifiques dont le prix est assez élevé ainsi qu'un PSM pour éviter les contaminations. Avec la richesse des milieux, une bactérie se développe à une très grande vitesse comparé à tes cellules et détruit ta culture.
Et quand à la durée du cycle cellulaire, 30 minutes je ne pense pas que ca existe au niveau eucaryote, la durée des cycles est d'environ 20h.

Par contre en fonction de ce que tu dois faire, vois peut être à changer de modèle, tu peux facilement voir des levures au microscope et elle demandent pas un grand entretient et leur cycle cellulaire dure environ 1h30. Et elle devraient bien pousser sur Milieu Sabouraud.

Dis en plus sur ton projet, on devrait pouvoir trouver une solution

[Wandrill3]

Bonsoir,

Tout d'abord merci pour la rapidité de votre réponse, je ne peux malheureusement vous en dire plus sur le projet auquel je travaille. Je peux toutefois expliquer la "zone" qu'il m'est nécessaire d'analyser. Il me faut des cellules d'une forme classique (epiderme oignon) car j'aimerai pouvoir les distinguer facilement. Des cellules en forme de synapse serait dur à distinguer l'une de l'autre si elles se "collent". Ensuite, j'aimerai pouvoir voir les cellules lors de leur mitose, car mon projet se penche particulierement sur cet aspect. Enfin, je cherche des cellules pas trop complexe, car il m'est necessaire de connaitre des protéines vitales à son fonctionnement et leur chaine pepitidique (je prends mes sources sur NCBI.org, peux tu me conseiller un autre site ?).
Je tiens à préciser que j'avais déjà tenté de la culture de Penicillium Roquefortii mais je me suis fait avoir (je suis qu'en 1ere ^^), j'ai pas fait attention que ce micro-organisme ne se perpetue pas par des moyens "classiques" (interpahse + mitose) et donc je n'ai pu valider certaine théorie.

N'hésite pas à me questionner d'avantage, si tu as besoin de plus d'information et je te tiendrai au courant de l'avancement de mon projet par mp des que les experiences auront été faites.

Merci

[invite144f2661]

Ben la pour les bases de données, NCBI reste le mieux à ma connaissance mais après vu ton niveau c'est pas adapté, il s'agit de la plus importante base de données mondiale. Pour tout ce qui touche à ton niveau je ne connais pas vraiment de sites à part celui-ci.

Mais le plus important c'est que ca a pas l'air de ton niveau un tel projet, sachant que tu veux faire des manips poussées sans connaissances et sans vraiment de matériel.

Après c'est quel type de projet que tu dois faire ?

Après,
Pour l'étude le cycle cellulaire, le problème c'est qu'il te faudrait des drogues que tu n'as pas comme ca... A savoir qu'elles sont extrêmement dangereuses et donc demandent du personnel formé.

Pour ton Penicillium, il faut savoir qu'il alterne entre reproduction sexuée et asexuée.

Après tu peux aussi voir avec tes profs ils doivent bien avoir un modèle d'étude à ta portée. Et à savoir que si ils t'en trouvent un il devrait être très bien connu.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Wandrill3]

En faites, je desire inhibée la synthèse d'une protéine responsable de la division cellulaire ou vitales. Cela permettrai de confirmer quasiment toutes mes hypothèses sur mon projet. Il me faut donc une cellule suffisament connu pour que je puisse trouver des protéines essentielles à son bon fonctionnement.
Je pensais, mettre en culture des cellules, les laissez se developper puis utiliser "mon projet" sur une protéine vitale des cellules et voire si la culture meurt ou pas. Si la culture meurt, mon projet se revelera efficace et j'aimerai le tenter sur des plantes puis des souris.

Merci encore pour tes réponses.

[TanguyE]

Bonjour,

Je pense que malheureusement tu t'attaques à quelque chose de beaucoup trop compliqué pour pouvoir faire ça chez toi. En effet, inhiber la synthèse protéique nécessite soit d'intervenir sur le génome de la cellule en "éteignant" le gène par mutation, soit d'utiliser une méthode appelée l'interférence ARN, soit l'emploi de drogues particulières qui seront difficile à obtenir. Ces solutions nécessitent énormément de ressources (bien plus qu'un incubateur et des boites de pétri) et des compétence qui, sauf erreur de ma part, ne sont pas maitrisées en 1ère.

De plus si tu n'as pas déjà une idée précise de la protéine que tu veux viser, je te souhaite bien du courage vu qu'il en existe pas mal qui sont impliquées dans le cycle cellulaire et encore plus qui sont "vitales". Bien entendu, une inhibition d'une protéine cellulaire vitale va nécessairement faire mourir tes cultures.

Désolé si mon message parait un peu dur et décourageant mais tu as encore plein de temps devant toi pour découvrir la biologie cellulaire

[Wandrill3]

Bonjour,

Justement, mon projet c'est d'inhiber la synthese protéique par quelque chose d'autre. Cette "chose" est le fruit de mes recherches avec mes professeurs. Le seul moyen de savoir si cette "chose" peut reellement atteindre la synthese protéique et bah c'est de le tester !
Pour la protéine vitale à visé, je sais comment la choisir, mais je ne peux pas la choisir si je ne sais pas quelles cellules cultivées ^^
Certes il est vrai que je ne suis qu'en 1ere, mais ce serai une erreur que de croire que je n'ai des connaissances que de 1ere, cela va faire 3mois que je travaille sur la synthèse protéique au point d'en savoir plus que mon prof de SVT et de physique sur ce domaine
La "chose" que je suis entrain de développer ne relève pas de leur compétence, c'est pourquoi je vous demande de l'aide.
Pour m'aider, je voudrai juste que vous me disiez quelles cellules peut on cultiver dans des boites de Pétri (sur un milieu gélosé de préférence). Cellules végétales ou animales ? Si je parle de cellules d'épiderme d'oignon, c'est parceque ce sont des cellules qui sont relativement grosse, de forme rectangulaire ou l'on distingue le noyau. En connaissez vous d'autres ? Quelle protocole utilisé pour mettre en culture ces cellules (faut il prendre une fine couche d'oignon et la posée sur la gelée ?) ? Es ce que les colorants comme le Rouge neutre, le bleu de Méthylène ou Feulgen peuvent inhiber le cycle cellulaire est donc tués des cellules (si oui, quel colorant utilisé afin de ne pas fausser mes résultats).


Je sais que j'en demande beaucoup, mais d'après mes profs, la "chose" que j'ai découverte d'après mes travaux pourrai bien être tout simplement "GENIAL". Evidemment je ne me prétends absolument pas le nouveau Einstein de 2012, mais mes profs m'encouragent vivement à exploiter mes découvertes "au cas ou".

En vous remerciant TanguyE et Axel33 d'avance.

[TanguyE]

Ok je comprend mieux.

Par contre il te reste un problème à prendre en compte, à savoir comment tu vas détecter ton inhibition de synthèse: western blot, RT-qPCR, gène rapporteur? Y-as-tu pensé?

Pour ce qui est de la culture de cellule en elle même, j'ai bien peur de ne pas pouvoir te conseiller. Mis à part te dire que tu n'a pas nécessairement besoin de voir le noyau. Des cellules il en existe des tonnes: voir ici...

[Wandrill3]

Pour ce qui est de détecter l'inhibition de synthese, je pensai voir le résultat en fonction de si les cellules mourraient ou pas. Si il se revèle qu'elles meurt, je pense contacté une université pour développer les expériences. Ne connais tu pas de cellules qui se cultivent facilement et ayant un cycle cellulaire par mitose ?

[TanguyE]

Le problème c'est que la mort cellulaire n'est pas un indicateur très précis, pas assez pour convaincre une université de regarder ton projet.

Pour ce qui est des cellules, j'en connais, mais elles ne se cultivent pas avec ce dont tu dispose. Mais bon pour info, les HeLa ou les HEK293 sont des modèles pas mal.

[Wandrill3]

Pour les universités, mes profs connaissent d'autres profs dans l'université. Ils m'ont dit que de toute facon on me donnerai une chance mais qu'une seul ! Pour le moment, je n'envisage pas encore de me rendre dans les labos de l'université (il s'agit de l'UTC à Compiègne) avant au moins deux mois (temps que tout mes travaux soit bien ficelés).

J'ai regardé les cellules que tu m'as proposé, je pense prendre la HEK293, qui d'apres les images que j'ai pu voir, me semble moins complexe à observer. Toutefois, la "chose" que j'étudie, peut avoir une influence sur le cancer donc je pense prendre les HeLa plus tard.
Nouvelles questions : Comment se procurer ces cellules ? Quel protocole utilisé pour les mettre en culture ? Et avec quoi se cultivent-elles ?

Je n'oubliera pas de te citer lors de futurs conférences xD

[TanguyE]

Voici un extrait de mon matériel et méthode de mon rapport de stage:

Les cellules HEK-293 sont cultivées dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) contenant du Glutamax, supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal, 2mM de L-Glutamine, 100UI/ml de pénicilline, 100µg/ml de streptomycine et 0,25µg/ml d’amphotéricine B à 37° dans une atmosphère à 5% de CO2.

Le seul soucis c'est que ça se cultive dans un PSM pour éviter les contamination par des champignons notamment.

Je suis pas sur que tu puisse te les procurer à titre personnel.

Pour ce qui est du côté pratique de la culture en elle même, si tu lis l'anglais je te conseille d'aller faire un tour ici

[Wandrill3]

Merci beaucoup pour tous ces renseignements, le site que tu m'as passé contient un grand nombre d'informations qui me seront tres utiles. J'ai appelé ma prof de SVT pour lui faire part de tes conseils et elle me dit que ce que tu me proposes et tres bien, mais que cela sera extremement dur à réaliser pour moi et avec le matériel dont je dispose.
Elle me demande de te demander si il n'y aurai pas moyen de cultiver des cellules vegetales comme celle de l'épiderme d'oignon (oui je sais que je n'arrete pas de le répéter, mais elle insiste sur cet aspect en pronant que "ca serait plus facile". Qu'en pense tu ?

[TanguyE]

Si il y a surement moyen de faire cela en cellule végétale. Mais là ça sort de mon domaine de compétences, la dernière fois que j'ai vu des cellules végétales sous un microscope doit remonter au lycée...

[Wandrill3]

Ok merci quand même, peux tu juste m'expliquer les differences entre cellules animales et vegetales ? (comportement, reproduction cadre de vie).

[TanguyE]

Mis à part ce que tu as déjà du voir en cours, je ne peux malheureusement pas t'en dire beaucoup plus que ça.

[Wandrill3]

D'acc merci pour toute ton aide, connais tu des gens qui serai succeptible de m'aider dans de la culture cellulaire végétale ?