Identification des acides aminés d'une plante

[kasmurdanto]

bonjour a tous ! dans le cadre des TPE ( travaux personnels encadrés ) , je cherche a réaliser une expérience visant a identifier les acides aminés présents dans une plante ( la bardane ) .
Cela vous semble il réalisable tout en sachant que je vais devoir par exemple faire un séquencage de l'ADN "manuellement" ?
Je vais devoir aussi obtenir de l'ADN sous sa forme la plus pure possible .
En gros je cherche un protocole pour l'extraction d'ADN puis pour l'identification de ses bases azotés , pour en déduire les acide aminés qu'il "fabriquera" par la suite .
Voila , je sais que c'est confus , mais j'espere que vous pourrez m'aider quand meme .
merci d'avance .
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[invite45437e70]

bonjour,
je ne suis pas vraiment expert dans le domaine, mais il me semble que pour les protéines il faut chercher du côté de l'éléctrophorèse.
Pour l'ADN, t'es-t-il possible de faire une PCR? = réaction en chaîne par polymérisation?

Dans un cadre plus simple, ou sans outils, de quelles infos disposes-tu? Si tu as une séquence d'ARN, tu peux remonter aux nucléotides...
Tiens-moi au courant à bientôt

[evie57]

Bonjour !

Peux-tu préciser à quel niveau d'études tu te situes et quel est le matériel à ta disposition ?

Un départ pour l'extraction c'est de penser à ce qui pourrait séparer les cellules, casser les membranes, dissoudre les lipides et filtrer les molécules inintéressantes

[Flyingbike]

du séquençage fait maison ?

trouvez autre chose !

[A voir en vidéo sur Futura]

[evie57]

Ben methode de sanger pour les courageux

[Flyingbike]

en TPE je ne pense pas qu'on ait accès a du matériel de PCR, des ddNTP, des fluorophores ou des gels de 50 cm, des primers, de quoi extraire de l'ADN assez propre, et le savoir faire qui va avec...

[invite45437e70]

oui en effet il faut au moins des gels de polyacrylamide pour "dissoudre" les protéines... entre autre comme dit flyingbike

[LXR]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

J'ai modifié ton titre. La prochaine fois tu choisiras un titre explicite.

LXR pour la modération

[kasmurdanto]

bonjour , merci pour vos réponses .
Je vais deja essayer pour commencer de répondre a vos questions .
tout d'abord je ne suis pas sur du tout de pouvoir faire une PCR , étant donnée que je n'ai pas la moindre idée du matériel nécessaire
même si j'ai bien compris le principe théorique .
si vous pouviez m'en dire un peu plus sur le coté pratique de la chose , ca m'avancerait beaucoup .

dans un cadre plus simple , et sans outils , de quelles infos disposes tu ?

Si tu parles d'informations sur la bardane , je n'en ai ... aucune .
Mais je vais vous expliquer ensuite le but de mon TPE , vous comprendrez pourquoi je veut étudiez la bardane .

mon niveau d'études ... je suis en premières S .... mais pitié , faites comme si j'étais en master de biologie et que j'avais un labo entier a ma disposition , meme si au final je ne peut pas réaliser mon expérience , toutes les infos que vous m'apporterez sur le sujet m'intéressent quand même .

concernant le matériel , mon lycée peut tout a fait en acheter , le seul problème pour l'obtenir est le prix , évidemment .
La encore quelques chiffres m'intéresserait , même un ordre de grandeur serait suffisant .

pour le but de mon TPE , je ne suis finalement pas obligés de passer par l'ADN .
L'ARN fonctionnerait tout aussi bien , même si je ne me suis pas du tout renseignés de ce cotés la .
En pratique , est ce plus simple d'extraire et de séquencer l'ARN ?


ps : je reprends les cours dans 5 minutes , pas le temps de vous expliquez le but de mon TPE , mais je le ferais ce soir ou demain , promis

[Flyingbike]

Si tu parles d'informations sur la bardane , je n'en ai ... aucune .
Mais je vais vous expliquer ensuite le but de mon TPE , vous comprendrez pourquoi je veut étudiez la bardane .

mon niveau d'études ... je suis en premières S .... mais pitié , faites comme si j'étais en master de biologie et que j'avais un labo entier a ma disposition , meme si au final je ne peut pas réaliser mon expérience , toutes les infos que vous m'apporterez sur le sujet m'intéressent quand même .

concernant le matériel , mon lycée peut tout a fait en acheter , le seul problème pour l'obtenir est le prix , évidemment .
La encore quelques chiffres m'intéresserait , même un ordre de grandeur serait suffisant .

pour le but de mon TPE , je ne suis finalement pas obligés de passer par l'ADN .
L'ARN fonctionnerait tout aussi bien , même si je ne me suis pas du tout renseignés de ce cotés la .
En pratique , est ce plus simple d'extraire et de séquencer l'ARN ?


ps : je reprends les cours dans 5 minutes , pas le temps de vous expliquez le but de mon TPE , mais je le ferais ce soir ou demain , promis

EN gros tu veux séquencer des morceaux d'ADN (ou d'ARN) pour voir quelle protéine ça fait.

Poiur commencer, sache qu'il y a de nombreuses séquences disponibles pour la bardane : voir ici

Pour séquencer, effectivement il faut du matériel de départ. ADN ou ARN, ça ne donne pas les mêmes informations. SI tu t'intéresses aux protéines, il faut mieux travailler sur du cDNA obtenu a partir d'ARN. Ca n'est pas plus simple expérimentalement, puisque une fois l'ARN extrait (plus délicat que l'ADN), il faut le rétrotranscrire en ADN (réactifs assez onéreux) et ensuite le séquencer comme on ferait avec de l'ADN génomique.

Je ne saisis pas encore l'intéret du travail donc dis nous en plus.

Pour te donner une idée des prix, rien qu'un thermocycleur c'est dans les 3000. Après il faut rajouter le matériel pour l'extraction (par exemple un jeu de pipettes, au moins 400 euros, une centrifugeuse, pareil, tout un tas de bricoles diverses,..) les réactifs (c'est inchiffrable). ET aussi quelqu'un qui sait le faire (très peu de gens savent séquencer a l'ancienne).

Pour info, une séquence faite par un prestataire coute quelques euros par échantillon.

Dernier problème : pour séquencer, il faut une amorce donc savoir un minimum ou on va (ou utiliser des amorces dégénérées)

[evie57]

En fait est-ce que ça irait pour ton TPE de montrer un ADN extrait par tes soins et d'expliquer comment l'analyser ?
Dans ce cas une extraction d'adn visible par tous est pas très difficile mais faut pas être exigent sur la pureté tu peux même réaliser ça en live devant tout le monde avec des produits pas chers
Pour le reste l'arn est délicat comme dit précédemment à manipuler.
Pour le matériel essaie de voir si dans ta ville il n'y a pas un IUT qui pourrait t'aider voire même t'expliquer on sait jamais ))

[kasmurdanto]

merci pour le lien flyingbike , même si ça a l'air d'être une sacré galère pour y accéder

bon je vous explique le but de mon TPE en 2 ligne .
Je pars du principe ( admis par tous ) que la production de viande est bien plus chère est difficile que celui de la production de céréales .
Dans le contexte actuel , il parait difficile de garder nos habitudes alimentaires ( jusqu'ici on se contentait de laisser mourir de faim la moitié de la planète ) .
En gros , il va peut être falloir consommer moins de viande , voir a l'extrême plus du tout , mais des problèmes de carences sont souvent évoqués .
Pour mon TPE , j'ai choisis l'extrême , le scénario serait que l'humanité doit se passer de la viande , et même encore plus , de toutes protéines animales ( poisson , oeuf ... ) .
Les carences paraissent inévitables , évidemment .
ce qui m'a intéressé , c'est de lire sur plusieurs forum que plusieurs plantes sauvages pourraient contenir toutes les protéines nécessaires a l'homme ( cela n'exclue pas les carences en calcium , en fer ... mais c'est déjà étonnant pour moi ) .
Au final je veut montrer qu'il serait extrêmement intéressant de cultiver ces plantes , d'un point de vue nutritionnel , même si ce n'est pas ça qui résoudra la faim dans le monde .
Je n'ai par contre jamais trouvés d'informations objectives a ce sujet .
J'ai donc pensés essayer de les fournir moi même .
voila comment j'en suis arrivés a vouloir faire cette expérience .

En fait est-ce que ça irait pour ton TPE de montrer un ADN extrait par tes soins et d'expliquer comment l'analyser ?

ca suffirait si j'avais au moins les résultats , même si ce n'est pas moi qui les ais trouvés .
j'habite une petite ville et pas d'iut a un bon paquet de kilomètre a la ronde ...

EN gros tu veux séquencer des morceaux d'ADN (ou d'ARN) pour voir quelle protéine ça fait.

c'est en effet ce que je voulais faire .

…

étant donnés que ca semble compromis , quel autre solution me reste il ?
J'ai pensé essayer d'identifier a la place les acides aminés «*essentiels*» présents dans les protéines de la plante , cela vous paraît il plus simple a faire ?

Désolé pour la réponse anarchique , mais je ne l'ai pas écrite en une seule fois ….

[kasmurdanto]

a ce sujet j'ai trouvé ce protocole qui me semble intéressant , mais j'aimerais avoir votre avis .
De plus , je ne suis pas sur qu'il permette d'identifier des acides aminés s'ils sont mélangés .
dites moi ce que vous en pensez .
merci beaucoup pour votre aide !

[kasmurdanto]

j'ai oublié de donner le lien dans mon dernier message et je ne peut plus le modifier
bref , voici le lien :
http://www.didier-pol.net/2FTCCMAA.html

[Flyingbike]

on sait qu'il y a tous les acides aminés dans cette plante la. Ce que tu peux faire c'est en doser certains pour comparer leur teneur par rapport a du steak haché par exemple .

Par contre tu voulais nous montrer un truc mais t'as du l'oublier !

[kasmurdanto]

j'avais effectivement oublier , mais j'ai redonnés le lien dans un de mes précédents messages .
je ne sais pas si tu l'as vus .

[kasmurdanto]

si ce protocole semble intéressant , il ne précise pas comment faire une hydrolyse .
J'ai trouvé ailleurs qu'il fallait obtenir une solution avec l'échantillon et du HCl à une concentration de 6 mol par litre .
puis qu'il fallait exposer la solution a une température de 110 degrés de 6 a 12 heure .
Et qu'il fallait finalement neutraliser la solution en ajoutant du NaOH .
Cela vous semble il correct ?

[Flyingbike]

le souci est que dans cette expérience, ils ont des AA purifiés.

Toi si tu fais un extrait, il y a des milliers de substances qui peuvent migrer sur une CCM. Il faudra peut être passer par une purification des AA, mais je n'ai aucune idée du protocole.

Au moins, essaie de te renseigner par rapport a la spécificité de la coloration.

[Preguicoso]

Bonjour,

Il y a plusieus techniques de purification des acides aminés.

Cependant personnelement, avec le matériel que tu peux avoir à disposition, je ferais un broyat de la cellule (tissu dans un mortier), met cela en solution dans de l'eau physiologique par exemple, puis tu fais une pré-purification en faisant précipiter les protéines avec du sulfate d'ammonium.

Normalement tu devrais faire une centrifugation, sans centrifugeuse et sans vouloir avoir une purification parfaite, je peux tu penses utiliser une essoreuse a salade que tu utiliseras comme centrifugeuse... Je te conseil de ternir TRES vite ^^ et un certain temps (minimum 10 min je dirais).

Si tu récupère le culot, tu peux espérer avoir éliminé une bonne partie de touts se qui est plus petits que les protéines.... (donc ADN principalement qui pourrait géner), cependant les organites est fragments cellulaire seront encore probablement dedans... Si tu veux diminuer ces fragments cellulaire, tu fais en deux étapes :

- Broyat
- Centri-essoreuse à salade --> Récupération du surnageant (les protéines libres dans le cytoplasme seront normalement présente)
- Précipitation des protéines au sulfate d'ammonium
- Centri-essoreuse à salade --> Récupération du culot.

Ton culot contient alors normalement, essentiellement (je peux pas te dire le pourcentage, j'ai jamais essayé comme cela....) des protéines. Tu resolubilise ton culot soit dans de l'eau soit dans l'HCl directement.

Tu peux faire alors l'hydrolyse, de 110°C en milieu HCl, je dirais plutôt 10 à 48h pour avoir une hydrolyse total car tu ne connais la composition des protéines (Si je me rappel bien cette hydrolyse détruit un ou deux type d'acide aminé mais je ne sais plus lesquel, si quelqu'un s'en rappel...).

Tu as alors une solution contenant des acides aminés.

Pour une première vérification et séparation, je te conseille une chromatographie sur couche mince (simple à faire, facile à comprendre,peu cher et les protocoles se trouve très facilement sur internet). Une fois migrer tu colores à la Ninhydrine (un coup de pinceau puis séchage), elle colore tous les acides aminés en violet, sauf la proline qui est colorée en jaune.

Le problème de la Ninhydrine est qu'elle est cancérigène... Il faudrait savoir si ton lycée te laisserai la manipuler....

Tu peux donc maintenant savoir, le nombre d'acide aminés contenu dans ton tissus (par le nombre de spot sur le chromatographie, si je me souviens bien tout les acides aminés migrent différement) et même savoir s'il y a de la proline ou non dedans (un spot jaune s'il y en as)! Cependant tu n'auras les acides aminés dégradé par l'hydrolyse....

Je pense que tu peux déjà faire sa sur ton steak haché, et sur différent tissus de ta plante (tout les tissus n'ont pas la même composition), pour au moins comparé la diversité d'acide aminé les uns par rapport au autres... Réfléchis quand même aux possible contaminations car une essoreuse à salade n'est pas une centrifugeuse....

Et niveau prix, je pense que sa revient à une centaine d'euros grand max....

Après si tu veux les identifier plus finement, ce revient un peu plus cher et plus compliqué....

Je te dirais simplement que tu peux faire un type de séquençage des acides aminés selon la Méthode de Sanger, donc comme les séquenceurs d'acides aminés, mais à la main... Pour cela il te faut : De la ninhydrine (encore), une colonne chromatographique (type échangeuse d'ions) et des échantillons des 20 acides aminés naturelle (et protéogénique) PUR.

Ici tu base l'identification sur le temps de rétention des acides aminés, selon leurs charges (le temps où il reste dans la colonne) après fixation et élution.

En gros, tu fais passer les acides aminés PUR un à un dans la colonne et tu mesures le temps (donc le volume d'élution en réalité) de rétention de ce type d'acide aminé dans la colonne. Tu identifie le(s) tubes qui contiennent les AA en les colorant à la ninhydrine. Je te conseillerai de faire des tube de 1 mL chacun pour bien différencier cela...

Entre chaque AA pur tu régénères la colonne (tu la "nettoie") par de la base ou de l'acide selon le type de colonne. Et tu fais cela pour chaque acide aminé pur!

Tu fais alors un graphique f(Volume d'élution) = Intensité de coloration de la nynhydrine, pour chaque AA, je te conseille de placer tout les pics sur le même graph, sa sera plus simple. Pour l'intensité de coloration, soit du le fait qualitativement (+++, ++ , + , +/- , -) soit quantitativement si tu a la change d'avoir un spectromètre sous la main.

Et pour la composition de tes échantillons, tout simple! Tu le fais passer dans la colonne, tu récupères bien TOUT les élutions (un peu plus que le volume sur tu avais pour l'AA pur qui à le plus grand volume d'élution).

Tu colores tout t'est tube à la Ninhydrine et tu peux savoir approximativement la composition en acide aminés de l'échantillon testé. (Tu a juste à reporter le volume d'élution du tube sur le graphique étalon fait auravant et tu auras le nom de l'acide aminé).

Voila j'espère t'avoir aidé,

Cordialement,

Preguicoso

[kasmurdanto]

merci beaucoup pour ta réponse très complète preguicoso .
C'est exactement ce que je cherchais , et il est vrai que je n'avais pas pris en compte touts les organites qui auraient rendus "impurs" mon hydrolise .
Je vous tient au courant , je devrais faire l'expérience la semaine prochaine .

[kasmurdanto]

voici mon protocole , dites moi si vous voyez une erreur :

PROTOCOLE TPE

I préparation de l'échantillon


1 .faire un broyat dans un mortier de la bardane

2 . faire une centrifugation ( une essoreuse a salade peut faire l'affaire )

3 récupérer le surnageant .

3 . mettre en solution dans de l'eau physiologique

4 .faire précipiter la solution avec du sulfate d'ammonium

5 . faire une centrifugation

6 . récupérer le culot .






II . hydrolyse de l'échantillon .


1 . placer dans un tube a essais (x) ml de l'échantillon .

2 .ajouter du HCl jusqu'à obtenir une concentration en HCl dans la solution de 6 mol par litre .

3 . exposer au moins 12 heure a une température de 110 degrés Celsius .

4 . ajouter du Na0H pour obtenir une solution dont le PH est très proche de 7 .



III . Identification des acides aminés .


1 . Placer le solvant dans la cuve sur une hauteur de 2 cm et fermer hermétiquement

2 . Tirer un trait de crayon sur la cellulose de la plaque à 3 cm du bord et parallèlement à lui

3 . Prendre le capillaire ( ou une micropipette calibrée ) disposé dans le tube contenant l’échantillon à analyser, essuyer son extrémité avec un essuie-tout puis déposer une microgoutte sur le trait à 1 cm du bord latéral gauche de la plaque

4 * . Procéder de la même manière pour chacune des 8 solutions d’acides aminés disposées dans les tubes en espaçant les gouttes d’environ 1 cm.

5 * . Faire un deuxième dépôt a 1 cm du bord latéral droit de la plaque .

6 . Placer la plaque dans la cuve à chromatographie contenant le solvant de développement.
Fermer hermétiquement le flacon .

7 . Laisser le développement se poursuivre pendant 45 minutes .

8 . Sortir la plaque avec des pinces et la sécher avec un sèche-cheveux (air froid).

9 . Sous hotte, tremper la plaque rapidement dans le révélateur puis laisser évaporer l'essentiel du solvant sous la hotte.
Finir au sèche cheveux chauffant , jusqu'à apparition des taches .

*étapes facultatives , réalisable s'il est possible d'avoir des échantillons des 8 acides aminés essentiels .

Matériels et réactifs nécessaires :
-Hcl - plaques de cellulose sur support souple ( papier d'aluminium )
-NaOH - capillaire
-butanol - acétone *
-acide acétique - ninhydrine *
-eau distillés . - sèche-cheveu
-pipette gradués

l'acétone et la ninhydrine sont utilisés pour le révélateur .
Mais La ninhydrine est cancérigène , il doit y avoir des révélateurs moins dangeureux .

solvants : butanol, acide acétique, eau (70, 18, 12 ; v %)

[Preguicoso]

Bonjour,

Alors alors....

Point I.2 : Pense bien a regarder le principe de "bac" des centrifugeuse pour modifier correctement ton essoreuse et fait éventuellement quelques tests pour voir le temps et la "vitesse" que tu devrais donner à cette centri improvisé

Point I.3 : Inutile de mettre ton surnageant dans l'eau physiologique... Un surnageant et par définition liquide! De plus tu as déjà suffisamment de liquide normalement car ton broyât devrais se faire avec de l'eau (il faut bien un solvant)

Point II.1 : Ici après récupération du culot, il te manque la solubilisation en eau physiologique! Le culot est la partie solide présente au fond du tube après centrifugation. Et évite de parler de X ml, en général tu en mais juste suffisamment pour solubiliser le culot. ==> Note : Pour enlever le surplus de sulfate d'ammonium qui fait précipité les protéines, il te faudra probablement faire des cycle "solubilisation - centri - récupération du culot" plusieurs fois de suite (la forte concentration en sulfate d'ammonium encore présent pourrait continuer a fait précipiter les protéines et gêner la suite de l'expérience.

Point II.4 : Je ne suis pas sur que replacer à pH 7 soit crucial... Autant le volume d'HCl à ajouter pour faire une solution à HCl 6 M est simple a calculé que replacé à pH 7 est plus compliqué... Il faut un pH-mètre (risque de contamination) car les acides aminés peuvent jouer un rôle dans le pH... De plus les acides aminés dégradé à pH acide ne se reformeront pas à pH 7...

Point III.3 : L'utilisation d'une micro-pipette calibrée n'est pas forcement utile car tu fait une étude qualitative et non quantitative (étude directe sur les spots de chromatographie)... Elle est juste utile si tu en as sous la main... Sinon des cures-dents auto-clavé (120°C , 1 à 2h ==> Cocotte minute par exemple) sont largement suffisant, surtout si tu fait attention de ne pas contaminer la point utilisé pour faire le dépôt avec tes mains. Sinon tu peux faire des capillaires très facilement avec des pipettes pasteur étirée à la main sur une flamme de bec Bunsen (j'ai déjà réussi a en allonger une sur environ 1m). Attention cependant si tu utilise un cure-dents ou un capillaire a faire des spot de taille équivalente si tu veux faire une analyse semi-quantitative (possible uniquement en comparant la proline aux autres possibles).

Point III.4 : Bon raisonnement la comparaisons avec les acides aminés normaux peut être utile, j'y avait penser avec les colonnes d'affinité mais pas en CCM. Cependant il y a 20 AA différents et non 8. MAIS avec 8 AA différent, si tu les connais tu pourras au moins identifier ceux-la!

Point III.7 : Attention ici! Cela la taille de ton aluminium silicié 45min peut être beaucoup trop! Attention à laisser le solvant monté jusqu'à 2-3cm du bord supérieur uniquement! C'est donc a surveiller régulièrement!

Concernant la nynhidrine, je ne pense pas que d'autre colorant sur utilisable uniquement pour les acides aminés... Eventuellement le Bleu de Coomassie mais je crois qu'il ne colore que les protéines....

Voila voila!

Preguicoso, qui repart bosser

[kasmurdanto]

merci pour ces petites rectifications bien utiles .
Pour la nynhidrine je peut finalement en utiliser .
Le ph , j'avais peur qu'il influence d'une manière quelconque le reste , j'hésite encore sur ce point la .
Concernant la centrifugation , j'ai un peu du mal a en comprendre le principe , mais je devrais pouvoir trouver des infos facilement sur le sujet .