immunohistochimie sur rein de souris

[invite4de42b13]

Bonjour!
Je suis étudiante en thèse à Munich, Allemagne.

Je dois faire une immunohistochimie sur des sections de rein de souris. J'utilise un protocole où je masque avec de l'eau oxygénée la péroxidase endogène puis je bout les sections dans du citrate de sodium pour réveler l'antigène. Je bloque avec de la BSA/PBS dans laquelle j'ai de la streptavidine puis le premier anticorps avec de la biotine dans la solution. Pour la révèlation j'utilise un second anticorps couplé à l'HRP puis la solution ABC (avidin-biotin complex) et enfin le DAB comme chromophore.

Mon problème est que je dois utilisé un anticorps assez faible du coup je dois incuber avec le DAB les sections longuement ce qui provoque un immense background et je ne peux plus voir quelles sont les cellules réellement positives...

Est ce que quelqu'un aurait une idée de ce que je pourrais faire pour éviter le background?

Merci
Kapou

PS: cet anticorps marche sans background sur des sections d'autres tissus
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[Angmar]

Bonjour,
es-tu sûre d'avoir besoin de l'étape d'antigen retrieval en citrate de sodium pour avoir un signal ? De plus, as tu fait les contrôles adéquats (sans ACI ou ACII) pour t'assurer que le problème vient bien de l'étape d'incubation en DAB ?
Moi j'essaierai:
- sans antigen retrieval
ET/OU
- en ajoutant de la BSA à toutes les étapes histoire de bloquer un maximum de sites aspécifiques

Sinon je ne vois pas, désolé .
Nb : je n'ai fait que de l'IF et jamais d'IHC, donc navré si mes suggestions sont un peu hors-contexte ^^

[invite4de42b13]

Bonjour,

Concernant les controles négatifs, j'ai utilisé un contrôle sans ACII j'obtient le même signal que sur la "vraie" section. Pour l'antigen retrieval, je pourrais essayer sans le citrate de sodium mais l'anticorps étant déjà assez faible je doute que cela fonctionne...
Dans toutes mes solutions (blocking, ACI,ACII) il y a de la BSA, il y a juste dans la solution ABC qu'il n'y en a pas.
Merci de ton aide

[Angmar]

Y'a-t-il une étape de perméabilisation dans les protocoles d'IHC (genre en PBS 0,1% Triton, ou autre chose dans le genre) ?
Peut-être faudrait-il en faire une ici, ou l'allonger, ou augmenter les doses de détergent.
Et/ou faire des lavages plus long, et un lavage supplémentaire après l'ajout de ton chromophore (quitte à le faire sur la nuit à 4°C)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite4de42b13]

Rebonjour,

En fait dans mon protocole c'est soit PBS triton soit citrate de sodium. Le problème c'est que le PBS triton ne peut pas être utilisé pour les protéines dans le noyau, ce que je veux détecter... Dans le cas de protéines nucléaire on utilise le citrate de sodium au microondes.Et comme en plus mon anticorps ne fonctionne pas très bien ca risque de poser problème.

Concernant les lavages je peux effectivement les prolonger mais après l'ajout de mon chromophore cela ne changera rien. Je met le chromophore sur ma section et je regarde au microscope jusqu'à l'apparition de la coloration. Dans le cas d'un anticorps fonctionnant très bien, la coloration peut apparaître en quelques secondes, dans le cas de mon anticorps je dois laisser le chromophore environ 5min mais dans ce cas là j'ai un énorme background. Une fois que la coloration est apparue je met la section dans l'eau puis je contre colore à l'hématoxilin, déhydratation et montage sous lamelle. Je doute que laver le chromophore overnight à 4°C aidera, je n'ai jamais fait de lavage après l'apparition de la coloration.

[Flyingbike]

Le problème c'est que le PBS triton ne peut pas être utilisé pour les protéines dans le noyau, ce que je veux détecter... .

Ah bon ?

je le fais, ça fonctionne

[invite4de42b13]

@Flyingbike: vraiment? je vais essayer alors merci du tuyau