Bonjour,
je suis en stage en labo bio mol, j'etais chargé de mettre au point des protocoles PCR real time!
j'ai effectué plusieurs PCR quantitative le but étant la mise au point des PCR, je sais pas comment interprété les resultats car mon stage arrive à sa fin et je ne peux pas aller plus loin dans mes experiences;
ce que j'obtiens c'est des courbes fluorescence en fonction du temps!
la question est dans quels cas je peux valider une PCR!
Merci
Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,
Que connais-tu sur la PCR en temps réel? Connais-tu la notion de cycle seuil (Ct = Treshold Cycle)? Sais-tu ce qu'est une courbe de fusion?
Never give up.
bonjour, merci beaucoup d'avoir repondu!
alors j'ai realisé plusieurs PCR, j'ai testé 4 gènes à la fois sur 3 souches d'un germe, c'etait la premiere fois qu'on tester les protocoles d'amplification.
j'ai réalisé ça dans un lightcycler de roche, vu que le but est de mettre au point les PCR je pense qu'il faut que je dise si mes PCR fonctionne bien pour ensuite commencer une vrai quantification d'ARN. quest ce qui me permet de dire si une PCR est bien mise au point??
je sait ce que c'est qu'un Ct, et l'efficacité est donnée par la droite Ct en fonction log[ADN].
DSL je sais pas si je suis clair!
La spécificité est donné par la courbe de fusion qui est dF/dt (où F est l'intensité de fluo, et t le temps) = f(T) (où T est la température). As-tu utilisé un gène de référence dot l'expression ne varie pas entre tes différentes conditions?
Never give up.
oui j'ai utilisé un gène de référence! son expression ne varie pas
Bonsoir,
Je suis entrain de faire des PCR en temps réel. j'ai utilisé comme gènes de références GAPDH et Beta2-microglobuline. le problème c'est que le cycle seuil
(Ct = Treshold Cycle) de mes gènes de références est plus élevé que celui du gène cible. CT référence =32 alors que CT cible=24. Est ce que c'est normal ou bien il ya t-il des mise à point à faire, tel que la quantité d'ADNc ou des amorces??? Merci d'avance
Dernière modification par DOCIPT ; 04/03/2014 à 19h52.
Il est effectivement possible que le Ct de ton gène cible soit plus bas que celui de ton gène de référence, cela signifie que ton gène cible est moins exprimé que le gène de référence. Donc pas d'inquiétude
