In situ d'oursin et sonde ARN

[babooche]

Bonjour

j'effectue actuellement mon stage de fin de licence de biologie dans un labo d'evo-devo où je réalise en ce moment des in situ sur des embryons d'oursin.

il y a 1 mois j'ai réalisé mon premier in situ avec comme sonde ARN un gène dont on connait le patron d'expression de manière à expérimenter la technique mais aussi pour me servir de ce gène comme controle positif.
j'ai eu les résultats attendus.

j'ai donc recommencé avec les sondes ARN des gènes à tester ainsi que mon contrôle positif mais je n'obtient aucune coloration même pour le contrôle +.

Voici le protocol que j'ai utilisé :

 Cliquez pour afficher

Lavage dans solution de réhydratation (50% MeOH/ 50%PBST)
Lavage PBST
2H30 dans solution d'hybridation à 65°C
toute la nuit dans solution hybridation + sonde (0,75ug/ml)
différents lavages à base de solution d'hybridation et de SSCT
solution de blocage
toute la nuit en présence d'Ac à 1/5000
lavage à base de solution d'alkaline phosphatase
révélation dans une solution contenant du NBT et du BICP

voyant que mes in situ ne marchaient pas j'ai testé les solutions mères. Elles sont correctes. j'ai aussi refais toutes mes solutions par précaution.

Je n'arrive pas à trouver pourquoi ça ne marche pas.
si quelqu'un ici à une idée je l'a testerai avec joie. Je pensais peut être ajouter une étape de digestion par une protéinase K avant de placer mes embryons dans le tampon d'hybridation. Vous en pensez quoi?

Sinon est ce que vous auriez des articles avec des protocoles d'in situ d'oursin car je n'ai trouvé sur internet que des protocol pour amphioxus.
Dans le pire des cas si personne ne peut m'aider, je ferai un mix d'un protocol pour amphioxus et du miens.


merci d'avance