Pcr

[Came31]

(re)Bonjour,

Voilà, je n'ai pas compris la correction d'un TD à propos de la PCR : Par le fait que l'on utilise des amorces oligonucléotidiques de synthèse, il est possible d'ajouter des séquences dans la région 5' de chaque amorce. Par exemple, un site de restriction aux 2 extrémités du fragment d'ADN synthétisé permettrons ultérieurement d'assembler le produit PCR dans un plasmide.
Je ne comprend pas vraiment...une sonde est complémentaire et antiparallèle de la séquence à étudier donc comment rajouter une séquence à l'extrémité 5' ? Celle-ci ne s'hybride pas ? Et puis une enzyme de restriction ne coupe que sur un ADN double brin donc je ne vois vraiment pas comment tout cel s'organise ...
Est-ce quelqu'un pourrait m'éclairer ? Merci d'avance !
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[Flyingbike]

C'est simple : l'amorce s'hybride partiellement, la partie qui contient le site de restriction et qui est donc indépendant de la région à amplifier "dépasse".


Pour la seconde question, il ne faut pas oublier que la PCR, par définition, produit des fragments d'ADN double brin !

[Came31]

Ah oui, je vois merci !
Mais d'aprés ce que j'ai compris, c'est sur cette partie de l'amorce "en trop" ou qui ne s'hybride pas qu'on insère un site de restriction. Donc à cet endroit là, comment l'enzyme de restriction va t'elle couper si elle ne peut le faire que sur une région double brin et que le site de restriction correspond justement à une zone non hybridée ou simple brin ?
Je ne sais pas si je suis trés claire :/

[Flyingbike]

Si, j'ai compris votre problème.

Si on considère l'amorce sens, au premier cycle, la partie 3' va flotter, et l'élongation se fera à partir de son extrémité 5', qui elle est bien hybridée au brin matrice. On aura donc un double brin avec un "bout qui flotte" que l'on appellera couramment 3' overhang. Sur cette molécule effectivement une enzyme de restriction ne coupera rien.

hybridation amorce sens
_____________ matrice
------ amorce (s)


élongation
_____________ matrice
------——————— nouveau brin



Au cycle suivant, l'amorce (antisens cette fois) va s'hybrider sur ce nouveau brin, complémentaire et antiparallèle du brin matrice. L'élongation permettra de produire un brin complémentaire a ce nouveau brin, jusqu'a son extrêmité 3' qui contient le site de restriction. A la fin de cette étape, on aura donc ADN double brin qui contient un site de restriction, double brin également.


hybridation amorce antisens

-------- amorce (as)
------——————— nouveau brin

élongation

-------------------------
------———————





Ce n'est pas du tout évident mais le schéma de wikipedia devrait vous aider : http://fr.wikipedia.org/wiki/Réactio...par_polymérase

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

les espaces n'ont pas été pris en compte, mais imaginez que l'hybridation de l'amorce antisens se fait "a droite" du nouveau brin