Immunologie, Treg, FoxP3, Navios!!

[RDBparis]

Bonjour,

J'aurais besoin de conseils SVP concernant le marquage foxp3. C'est la première fois que je marque au foxp3, et j'utilise comme automate un Navios de Beckman. J'utilise un kit de perméabilisation de chez DB...et je vais faire un 6 couleurs! Mon problème c'est que pour créer mon protocole, j'utilise du sang frais (tot) pour régler mes PMT et créer mon application automatique pour les compensations! Dois-je dans ce protocole traiter les monomarqués de la même manière que je traite mon tube de vérification? càd, dois-je passer par l'étape de perméabilisation et tous les lavages?? Je suis bloquée!

Merci de votre aide et vos conseils...
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[random_postdoc]

Pour faire les compensations ca n'a pas tellement d'importance que les échantillons monocouleurs aient subi le même traitement que tes marquages multicolores, tu peux même faire les compensations avec des billes marquées au fluorochrome d'intérêt une fois que l'intensité des PMT est réglée.

Ce qui est très important c'est de faire subir le même traitement aux vrais contrôles, c'est à dire les échantillons marquées avec isotype contrôle et les marquages contrôle fmo (fluorescence minus one). Et surtout choisis les bons fluorochromes (ie ceux avec une intensité forte) pour foxp3 et CD25 vu que les marquages peuvent être faibles et pas définir des populations très claires, respectivement PE et APC c'est ce qui marche le mieux à ma connaissance.

[RDBparis]

Bonjour,

Merci random_postdoc pour votre réponse...elle m'amène par contre à poser plus de questions A quoi servent les contrôles fmo? Et si j'ai un 6 couleurs cela veut dire que je dois avoir 6 tubes contrôles fmo (je passe après à un 8 couleurs)? et sur le sang d'un même sujet? à part les isotypes contrôles? En fait, il me faudra 1ml de sang, or mes sujets sont des bébés! ça va être un peu compliqué

En fait, oui, pour les réglages (à la création du protocole) j'utilise du sang tot (je ne peux pas régler mes voltages sur autre chose, les billes chez beckman n'existe qu'en cytocomp justement pour les compensations)! Et donc vous me dites qu'à ces tubes qui me servent de régler les PMT ce n'est pas important de leur faire subir le même traitement! dans ce cas, je n'aurai pas de problème de taille/structure lorsque je passe mes contrôles et mes échantillons d'intérêt? je peux être complètement à côté de la plaque

Sinon j'utilise un foxp3 APC et un CD25 PC5.5

Merci encore de votre aide.

[random_postdoc]

En effet les etapes de fixation/permeabilisation peuvent modifier taille/structure et intensitee de fluorescence. Donc en effet dans l'ideal, le mieux est que les monocouleurs aient subi le meme traitement que les echantillons analyses, mais en general les modifications seront pas assez majeures pour qu'il y ait de problemes. De toute facon tu vas regler SSC/FSC et le voltage des PMT avec un echantillon non marque qui lui doit avoir subi tous les traitements (comme les echantillons marques isotype), j'avais oublie de le preciser dans mon premier post.

Les marquages FMO c'est un controle de plus pour la specificite de ton marquage, pour verifier qu'il n'y a pas de faux positifs dans ta population d'interet. Par exemple la ca vaut le coup de faire un FMO pour foxp3 (em mettant l'isotype correspondant a la place de l'anti-foxp3 dans ton mix), enfin dans l'ideal c'est bien de le faire pour tous les marqueurs mais pour ceux que tu va a priori utiliser (j'imagine cd3, cd4, cd8) et meme pour foxp3, les anticorps et protocoles sont quand meme bien caracterises donc te fais pas trop de soucis.

Le mieux serait quand meme qu'avant de passer a tes vrais manips sur des echantillons precieux, tu test tout ca sur du sang d'un volontaire adulte ou t'auras assez de volume (et les Treg c'est pas une population rare, pas besoin de 4 litres de sang), comme ca tu auras en plus des reglages predefinis que tu pourra utiliser avec de legers ajustements pour tes futures analyses.

[A voir en vidéo sur Futura]

[RDBparis]

Désolée du retard,

Merci beaucoup de votre aide et votre réponse J'ai réussi!