Migration SDS PAGE

[ghotib]

Bonjour,

J'ai un problème actuellement avec la migration de mes gels SDS PAGE.

Ce sont des gels pré-coulés, 10% BIS-TRIS...donc pas de soucis quant à leur fiabilité ou fabrication.

Le problème viens de la migration (200Volt constant, ampérage se régule seul), qui est réalisée en tampon MES (50mM mES, 50mM Tris Base, 0.1% SDS et 1mM EDTA), la migration du gel se passe bien, la séparation du poids de marqueur moléculaire est jolie et bien distincte, mais après coloration au bleu de coomassie (1H sous agitation), et décoloration à l'eau tiède: la moitié basse du gel est complètement flou (même pour les PM qui était joli 1H avant).

Je suis ce protocole depuis toujours pour la migration des gels en tampon MOPS (protéine standard), et je n'ai aucun soucis. Le fait de passer en tampon MES (protéine de faible poids) me donne des gels illisibles.

Voici un exemple:
1er gel migré en tampon MOPS (qualité OK)
2ème gel migré en tampon MES (moitié basse du gel illisible)

MOPS.jpgMES.jpg

Je fe fais pas de fixation du gel au méthanol ou autre à part juste coloration au bleu et décoloration à l'eau tiède (qui marche très bien en tampon MOPS).

D'où cela peut-il venir?

Merci d'avance pour vos éléments de réponses!
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[ghotib]

A priori personne n'a de problème en SDS PAGE ????

allez...un coup de main....!!!!!

[biseibutsu]

Donc, en gros, tes protéines de faibles poids moléculaire "bavent"...
Pour ma part, je ne fais jamais migrer les protéines à 200V, mais à 100. c'est plus lent, mais cela peut peut-être régler le problème.

J'ai eu le même problème à une époque. Je m'en suis sorti en refaisant toute mes solutions. et c'est redevenu comme avant : bien.

Sinon, comme tu le sous-entend, peut-être fixer les protéines? Même si cela serait surprenant, car cela signifierait une diffusion des protéines à l'intérieur du gel... Mais si tu veux enchaîner sur un WB, c'est pas l'idéal.