primer with (too!!!) long tail?

[franckeeuuhh]

bonjour tout le monde,

maintenant que mon CsCl gradient est réglé je me pose une autre question.
J'ajoute souvent des sites de restriction à mes produits de PCR pour faire du clonage dirigé, mais ça n'excéde jamais les 8pb de plus.
Je suis en train d'imaginer une nouvelle manip et j'aimerai savoir jusqu'à combien de bp je peux ajouter... Là pour le mieux j'en suis à 38bp de plus sur mon oligo (que je devrais bientôt rebaptiser mon macro) plus ma séquence de 15bp qui bind à ma séquence d'intérêt. Que du bonheur quoi!!!

Donc ma question est la suivante, est-ce possible ou alors que dois-je faire, je me m'imagine pas faire une PCR et un sub-clonage de 38bp! Peut être utiliser des primers qui overlap mais est ce que je peux toujours amplifier ma séquence sur mon gène d'intérêt???

beaucoup d'interrogation en ce jour

merci d'avance,

Franck
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[franckeeuuhh]

en fait je n'ai besoin que de 30bp en plus... pas certain que 8nt face quelque chose mais je précise lol

[franckeeuuhh]

ma question déchaîne les foules apparament!!! Comme je vous comprend lol
aller je m'écris ça va la faire remonter un peu
best, Franck

[r@m16.2]

Bonjour,
étant aujourd'hui dans la même situation, j'aimerais avoir ton retour.
as-tu ajouter tes 30 nucléotides? et comment?

Merci

[A voir en vidéo sur Futura]

[mantOs]

Bonjour,

je sais pas si j'ai bien compris le probleme, mais si oui :

2 amorces qui overlap devraient etre OK.
Par exemple une premiere avec 20nt dans le gene et 20nt de ce que vous voulez ajouter, faite une premiere PCR avec cette amorce (+ le rev complementaire) et sur ce produit de PCR une deuxieme PCR avec une deuxieme amorce contenant donc 20aine de nt de ce que vous venez d amplifier dans la premiere PCR et completez pour finir la sequence que vous voulez.

Je sais pas si j'ai moi aussi ete clair.


PS: desole je n'ai pas d'accent sur mon clavier

[franckeeuuhh]

Merci mantOs
Je n'avais pas penser à faire une nested-like.
Je n'ai pas eu le temps de la faire avant donc c'est tout frais c'est d'hier.
J'ai fait un gradient toutes les 5°c de 45°C à 65°C. Et j'ai des bandes spécifiques à chaque fois.
J'ai cloné tous les produits de PCR dans le pGEMT et j'ai transformé des DH5a.
Après extraction des plasmides et digestion ma construction semble être la bonne.
Il faut encore que je valide par séquençage. Je dois avouer aussi que dans mon cas c'est assez simple vu que dans les 30nt que j'avais à insérer il y a un site de restriction, j'ai donc pu valider mes constructions en digérant par cette enzyme.
Si jamais mon résultat n'est pas concluant après séquençage je tenterai la nested-like.

je donnerai les conclusions de mon séquençage dès que je les aurai mais pour l'instant ça me semble très prometteur (je ne veux pas m'emballer mais quand même lol)

merci encore,

à bientot, Franck