Mise en évidence de protéines membranaires

[HUGEPONEY]

Bonjour, je suis actuellement bloqué sur une démonstration de la localisation des protéines (si elles sont transmembranaires ou périphériques) il est marqué dans mon cours :

"Exemple de démonstration basée sur l'utilisation des fantômes de globules rouges : après l'éclatement des membranes dans une solution hypotonique, en fonction du milieu dans le quel on met les membranes, on peut obtenir différents types de structures, fantômes ou vésicules, vésicules dites à l'endroit (dans la même disposition que la membrane cytoplasmique) ou vésicule
retournée ou à l'envers.

On met les deux types de vésicules en présence d'un réactif cavalent, soluble dans l'eau, mais qui ne traversera pas les membranes, ce réactif étant marqué par la radioactivité. On solubilise
les membranes dans un détergent et on sépare les protéines sur un gel de polyacrilamide-SDS puis on détecte les protéines par autoradiographie sur gel.

Exemple de résultat : avec les vésicules à l'endroit on n'observe qu'une bande, avec les vésicules à l'envers, on détecte deux bandes, dont l'une est identique à celle du premier gel.
Conclusion on a détecté une protéine transmembranaire et une protéine périphérique ou intrinsèque mais insérée seulement du coté intracytoplasmqique." Pr N. Boehm : Faculté de médecine strasbourg.

Le liens du cours avec les illustration (Bas de page 5) :

http://www.google.fr/url?sa=t&rct=j&...51156542,d.ZGU


Bon voici mon problèmes :

Je comprends le principe de l'expérience mais pas son interprétation. Comment peut on savoir si la protéines est transmembranaire ou périphérique car pour comparer les deux vésicules il
faudrait qu'elles soit identique. Non ? j'ai bien compris qu'ils compare les même protéines par éléctrophorèse je suppose. Mais sur une vésicule la protéine pourrait être sur la face extracellulaire et sur l'autre vésicules la protéine pourrait être sur la face intracellulaire. Ou alors ils cherchent des protéines dont ils savent qu'elle sont que sur une face ? Mais ça n'a pas de sens de chercher des protéines que l'on à déjà localiser..

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[Cliolamuse]

Bonjour,

si je résume (grossièrement): une bande de signal apparaît sur le gel d'électrophorèse, si le réactif radioactif présent dans la solution est venu "s'ancrer" à l'extrémité libre d'une protéine.

L'expérience se fait sur la vésicule à l'endroit (face extracellulaire en dehors) puis sur la vésicule à l'envers (face intracellulaire en dehors). (comme un pouf qu'on aurait vidé de sa mousse et retourné à la manière d'une poche de pantalon): la première te permet de "voir" les protéines présentes sur la face extracellulaire (ce qui s'est collé sur la poche ton pantalon) et la seconde celle présente sur la face intérieure (intracellulaire) (ce qui s'est collé à l'intérieur de la poche de ton pantalon). Pour les protéines trans-membranaires, tu auras donc le signal sur les deux faces de la vésicule (le bonbon qui fond, çà colle à l'extérieur et à l'intérieur de ta poche).

Si je reprends l'exemple: - la vésicule à l'endroit te donne une bande: tu sais donc qu'il y a une protéine qui présente un "morceau" extracellulaire. Mais tu ne sais pas encore s'il s'agit d'une protéine trans-membranaire ou périphérique.
- la vésicule à l'envers te donne 2 bandes: la première (la même que sur la vésicule à l'endroit) correspond à la protéine qui t'a déjà donné un signal sur la face extracellulaire: tu es donc en présence d'une protéine trans-membranaire. Le second signal qui n'apparaît pas sur la vésicule à l'endroit correspond donc à une protéine intrinsèque (périphérique) intracellulaire (puisque le signal apparaît sur la face extérieure qui est la face intracellulaire pour la vésicule à l'envers).

Est-ce plus clair pour toi?

A +
Cliolamuse

[HUGEPONEY]

Bonjour Et merci de m'avoir répondu !
Comme je disais le principe de l'expérience je l'ai compris. Mais se qui me chiffonne c'est que l'on fait l'expérience sur deux vésicules différentes. Comment être sur que la protéine repéré sur la deuxième vésicule (à l'envers) n'est pas transmembranaire, car c'est une autre vésicule. C'est cela que je comprends pas. C'est comme en (reprenant votre métaphore) si je comparais deux pantalons, en regardant à chaque fois une seul face.

Par exemple : si je regarde la face interne du pantalon 1 et que je vois une bonbon collé puis je regarde la face externe du pantalon 2 et je ne vois rien, ça ne veux pas dire que le bonbon sur le pantalon 1 n'a pas traversé le tissus.

[Cliolamuse]

De rien

Le truc est que l'exemple est une analyse des protéines de la membrane cytoplasmique des hématies. Les vésicules sont toutes issues d'hématies ayant subies un choc osmotique. Tu n'as pas qu'une vésicule en expérimentation: tu en auras plusieurs à l'endroit et plusieurs à l'envers mais elles représentent toutes la membrane érythrocytaire. C'est les mêmes vésicules, les mêmes pantalons cellulaires lol. Après le jean Lewis, le jean "L'erythr" hum...

[A voir en vidéo sur Futura]

[HUGEPONEY]

AHHHHHHHHHHHHH !!! exact ! Mince je suis bête.

Récapitulons si tu veux bien : l'Avancement par éléctrophorèse est unique pour une même protéine ? bon sauf si deux protéine on le même poids moléculaire. Donc si sur une vésicule à l'endroit on repère une protéine A et sur une vésicule à l'envers on repère une protéine A et B, la A est transmembranaire
et la B est soit périphérique soit intrinsèque mais que dans un des deux feuillet en l'occurrence le feuillet interne de la membrane cytoplasmique puisqu'elle est à l'envers.

Ceci en considérant que les protéines sur un même type cellulaire soit les même ? Mais ça peut enfaite aussi marcher sur des types cellulaires différents puisque on peut savoir qu'elle protéine on étudie avec l'électrophorèse (si la question suivante est juste)

Une dernières questions, peut être idiote, mais une même protéine, peut elle être une fois périphérique et une fois exprimé en transmembranaire ?

[Cliolamuse]

D'accord avec ton récapitulatif.

Les bandes en électrophorèse correspondent aux poids moléculaires des protéines révélées par, ici, l'agent radioactif, en effet.

Maintenant, le dogme de Watson t'enseigne que ADN --> ARNm --> Protéine(s). Une protéine est donc issue de l'expression du code génétique. Bien que les cellules de ta peau et les cellules de tes muscles, par ex., contiennent la même information génétique, leur différentiation réside dans le fait qu'elles n'expriment pas la même information selon qu'elles appartiennent au tissu "peau" ou au tissu "muscle". Elles ne synthétisent donc pas les mêmes protéines. Il ne faut pas oublier que les protéines ne sont pas toutes synthétisées au même moment, qu'il y a un turn-over, etc... Cependant, la membrane et sa nature (combien de % de lipides/protéines, protéines trans-membranaires par ex.) font bien parties des caractéristiques de chaque type cellulaire. Pour la simple et bonne raison que les protéines membranaires sont pas là pour le decorum mais bien pour jouer un rôle dans le métabolisme, dans le maintien, etc... bref dans la fonction cellulaire.

Pour d'autres types cellulaires, je ne suis pas sûre qu'on puisse créer des fantômes de cellules autres que des hématies (si quelqu'un(e) peut confirmer...). En effet, les globules rouges sont faciles à étudier de ce point de vue car pas de noyau et pas d'organites donc une seule membrane= la membrane cytoplasmique.

Tu auras donc d'autres techniques pour les autres cellules telles que la cryofracture (pour la localisation et la mise en évidence), l'électrophorèse des protéines membranaires solubilisées (pour la taille et le nombre d'unités, ...), la modélisation (fonction, structure qui peut être un indice sur la nature de la protéine (plus d'hélices alpha et de feuillets béta chez les P trans-membranaires...),...

Pour ta dernière question, lors de la synthèse d'une protéine périphérique, il me semble qu'il y a un passage à l'état de "protéine trans-membranaire" avant clivage et derniers ajouts (glycosyl, etc...) mais çà se passe dans le RE pas dans la membrane cytoplasmique. Hors cette étape, je n'ai pas entendu parlé de ce genre de protéine et je ne pense pas que ce soit un système "rentable" en terme d'énergie pour une cellule vivante active. Quel rôle pourrait avoir ce genre de protéine? Peut être lors de l'apoptose? Je ne vois pas mais je ne suis pas une biologiste cellulaire ni une biochimiste pure donc. (Par contre, tu peux avoir des protéines périphériques liées à des protéines trans-membranaires.)

[HUGEPONEY]

D'accord ! En tout cas merci beaucoup pour tes explications, tu m'as bien aidé

[Flyingbike]

Une dernières questions, peut être idiote, mais une même protéine, peut elle être une fois périphérique et une fois exprimé en transmembranaire ?

Si j'ai bien compris la question, oui cela existe. Il existe des protéines qui peuvent être transmembranaires ou non selon un clivage post-traductionnel ou selon un épissage alternatif.