Bonjour,
Je suis étudiante en biologie et le professeur nous a demandé de rédiger un exercice de TD. Le problème c'est que je n'ai aucune idée de comment le faire convenablement. J'ai pensé vous envoyer une copie de ce que j'ai fait pour avoir des critiques. Ce n'est pas un exercice noté, il y aura juste une appréciation donnée mais le professeur nous a dit que ce sera le même type d'exercice pour les partiels et j'aimerais prendre les bons réflexes et apprendre les bonnes formulations le plus rapidement possible pour m'en sortir, surtout que la rédaction ce n'est pas vraiment mon fort. Merci d'avance pour vos commentaires. Soyez le plus critique possible s'il vous plait. La seule chose, c'est que je ne peux pas inclure les schémas (car ils sont fait mains). Merci
Introduction :
En 1953, Watson et Crick élucidèrent la structure de l'ADN. Cette molécule comporte deux brins polynucléotidiques antiparallèles, enroulés autour d'un axe, formant ainsi une double hélice. Les deux brins s'associent spontanément grâce à la complémentarité de leurs bases qui s'apparient par l'intermédiaire de liaisons hydrogène.
(Schéma de l'hélice, indication pas)
1/ ne pas oublier d’indiquer le sens des brins
2/ indiquer les bases et les liaisons hydrogènes
3/ montrer les liaisons phosphodiesters
Les ligases catalysent les liaisons phosphodiesters entre les nucléotides de fragments complémentaires. Leur action peut donc aboutir à la circularisation des fragments d’ADN dont les extrémités sont complémentaires. L'étude de ce processus de circularisation pourrait-elle préciser les caractéristiques de la double hélice d’ADN en solution ?
On décide d’étudier la relation entre vitesse de circularisation et longueur des fragments en paires de base.
Développement :
Pour répondre à cette question, une séquence connue d’ADN double brin a été fragmentée par des endonucléases. Les extrémités des nouveaux fragments formés sont dites « cohésives », c’est à dire complémentaires.
(Schéma de fragmentation)
Les fragments obtenus sont séparés par une électrophorèse sur gel (agarose ou polyacrilamide). Les groupements phosphate charge l’ADN négativement. Les fragments d’ADN de petites tailles migrent plus loin sur le gel, vers le pôle +, que les fragments d’ADN plus longs. Ils peuvent être mis en évidence par le bromure d’éthidium, un agent intercalent qui fluoresce quand on expose le gel aux UV. Les fragments apparaissent alors sous la forme de bandes roses sur le gel.
(Schéma première electrophorese)
Le critère de séparation des fragments est leurs nombres de paires de base. L’électrophorèse sépare 11 fragments d’ADN. Grâce à des marqueurs de poids moléculaires, on estime leurs longueurs comme variant de 220 à 260 paires de bases. Les différentes bandes ou fragments identifiées sont ensuite découpées dans le gel d’ agarose. Après avoir fait fondre le gel, les fragments d’ADN sont traités séparément à la ligase, puis sont de nouveaux soumis à une électrophorèse pour évaluer leur vitesse de circularisation, processus rendue possible par la complémentarité des extrémités cohésives des fragments formées par les endonucléases.
(Schéma deuxième electrophorese)
Une fois circulaire, l’ADN fait des boucles et s’enroulent sur lui-même. Il migre donc moins bien que l’ADN linéaire sur le gel de l’électrophorèse. On devrait donc obtenir les profils de migration suivants :
(Schéma comparatifs des deux profils avant et après réaction de ligation)
À partir des données recueillies, on peut alors établir le graphe de la relation entre vitesse de circularisation et longueur des fragments d’ADN :
(Recopie du graphe)
La courbe du graphe n’est pas linéaire mais à un aspect cyclique ou sinusoïdal. On observe deux pics de vitesses, pour deux fragments de 242 et 252 paires de bases. Ces deux fragments ont la même vitesse de circularisation même s’ils diffèrent de 10 paires de bases.
Théoriquement, 2 brins d’ADN dont les extrémités sont complémentaires s’associent de manière spontanée. S’il n’y avait aucune contrainte physique, on pourrait s’attendre à ce que la vitesse de circularisation d’un ADN double brins dont les extrémités sont complémentaires soit constante et la plus rapide possible, leur composition chimique étant invariable. Mais d’après le graphe obtenu, ce n’est pas le cas.
Le processus de circularisation d’un fragment d’ADN fait intervenir 2 étapes : l’appariement des brins opposés complémentaires et la réaction de ligation entre les bases. La réaction de ligation étant la même quelque soit la longueur du fragment, il parait peut probable que la ligase soit à l’origine de la différence observée entre les vitesses de circularisation. Donc si la circularisation de certains fragments apparaît plus lente, c’est probablement parce qu’ils sont soumis à des contraintes physiques. La longueur de certains brins demanderaient un réarrangement du pas ou surenroulement de leur hélice pour que les deux extrémités opposées se rencontrent, s’apparient et puissent subir l’action de la ligase.
Conclusion :
L'ADN porte l'information génétique nécessaire à la synthèse des molécules du vivant. C’est une structure dynamique. Certaines techniques de biotechnologie, dites « recombinantes », manipulent sa structure. Elles font intervenir des endonucléases, pour couper l'ADN plus ou moins précisément, et des ligases pour rassembler les séquences d’intérêt dans un plasmide ou ADN circulaire. Bien qu’utile pour les techniques de biotechnologies, l’étude du processus de circularisation peut aussi permettre l’étude structurelle de la double hélice. En effet, toutes les hélices n’ont pas la même topologie. Par exemple, les hélices A, B et Z n’ont pas le même pas.
Le protocole suivi plus haut semble pouvoir mettre en évidence le nombre de résidus nucléotidiques par pas lorsque l’hélice n’est pas superenroulée. Cependant, l’expérience exposée comporte certaines limites. Une erreur de manipulation des fragments entre les deux électrophorèses pourrait avoir faussé le graphe sur lequel s’appuie notre réflexion. Il faudrait tester la reproductibilité de l’expérience pour confirmer les résultats obtenus. De plus, afin de valider l’aspect sinusoïdal de la courbe et aller dans le sens de l’hypothèse émise que le pas est bien de 10 nucléotides, il faudrait refaire l’expérience en incluant un plus grand nombre de fragments de tailles différentes. L’utilisation d’une autre endonucléase sur la même séquence d’ADN et l’obtention des mêmes résultats permettraient aussi de renforcer notre hypothèse.
Fin
Si vous ne vous êtes pas encore enfui, merci d'avoir lu et bonne soirée!
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