q PCR: Ct trop variable

[Leaphy]

Bonjour,

Je vous expose mon problème. J'éffectue une étude d'expression de gènes sur un grand ensemble.
Voila comme j'ai beaucoup d'échantillons à tester, au labo, on a décidé de faire les tests de mise en route (amorces - gamme étalon) sur une machine 96 puits
et le passage des échantillons sur une à 384 puits après un passage au robot de dépôt sur plaque.

Tout mes test se sont passé nickel mes gènes de ménage sortant à 21 pour RPII et 20 pour Actine.
Cependant sur l'autre machine, rien ne va plus:
Mon échantillon de gamme pur ne donne aucun résultats,
RPII sort à 30 cycles et Actine à plus de 35.

Du coup j'ai re-testé sur la première machine je retombe sur mes premiers résultats et l'échantillon de gamme pur, qui ne donnait rien, marche de nouveau.
Les deux programme sont similaire, par contre on met plus d'ADNc et d'amorces dans le deuxième cas.
Pour 10µl de réaction: on passe de 0.2µl à 0.5µl d'amorces à 10µM et de 1µl à 3µl d'ADNc.

J'ai questionné d'autres personnes qui font des analyses similaires, elles n'ont pas d'explications bien au contraire la tendance est de gagner 1 à 3 cycles et non d'en perdre 10.

Merci et bonne journée
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[piwi]

Bonjour.

Compte tenu de ce que vous dites, le problème semble venir de la machine. Existe-t-il un volume minimal recommandé par échantillon pour cet appareil? Ne seriez vous pas en dessous?
Dans la même idée n'existe-t-il pas un seuil de fluorescence sur l'appareil, et ne mettez vous pas trop eu de Sybrgreen ou autre?

Sinon, toujours aussi trivial comme commentaire, avez vous essayé de faire une réaction PCR dans la machine 96 puits dans les contions de volume de la 384?

Cordialement,
piwi

[Leaphy]

Bonjour.

Tout d'abord merci de votre réponse.

Les volumes minimaux sont respectés et le SybrGreen est utilisé selon les recommandations indiqués pour les machines.

Par contre les kits SybrGreen viennent de 2 origines différentes.
Le deuxieme étant plus photosensible que le premier, j'avais peur que le problème viennent de là.

J'ai testé le ration ADNc/amorces avec 1.2µl d'ADNc pour 0.2µl d'amorces (ce qui correspond au ratio 3µl d'ADNc pour 0.5µl d'amorces) qui avait marché.
Vu que mon ancienne gamme ne me servira plus, je vais essayé les conditions identiques (kit et concentrations) dans le courant de la semaine prochaine.

Je vous tiendrais au courant des résultats.
Toute idée est bienvenue

Cordialement,
Leaphy