Immunofluoresence

[mzbercelin]

Bonjour à tous,
Voila dans un article je n'ai pas bien compris une manip:
les gars ont menés une expérience de colocalisation par immunofluorescence entre l'AAV2 et la clathrine en utilisant un fluorochrome fixé avec l'AAV2 (Alexa488-labeled AAV2) qui vire en vert et un anticorps contre la clarhrine (rouge). Bref, je ne comprends pas bien la manière dont ils ont procédés et de quoi je ne suis pas familier avec cette technique. Quelqu'un peut il m'aider?

N.B: Voilà ce qui est écrit : Les cellules HEK293T ont été incubées avec l'Alexa488-labeled AAV2 (green) pendant 30 min à 4°c pour sinchroniser l'infection et elles ont été transférées à 37°c pendant 5 et 10 min. Après incubation, les cellules ont été fixées, perméabilisées et immunostained avec un anticorps contre la clathrine (red).
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[noir_ecaille]

Les références de l'article ou un lien vers celui-ci serait souhaitable -- surtout qu'il y a citation

[mzbercelin]

la réf: Endocytic processing of adeno-associated virus typ... [Gene Ther. 2013] - PubMed - NCBI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?...llschiTrouveez ci joint le fichier...

Pièce jointe supprimée

[JPL]

Désolé mais le pdf mentionne en en-tête All right reserved. Il ne peut donc pas être mis en ligne ici.

Et sur la page de Nature : To read this article in full you may need to log in, make a payment or gain access through a site license .

[A voir en vidéo sur Futura]

[camulus]

Salut,

C'est difficile de répondre sans avoir l'article sous les yeux.

Mais si tu veux mon avis ils veulent savoir si ton virus AAV est endocyté via les puits de clathrine des cellules HEK. Donc ils incubent les cellules avec le virus couplés au fluorophre Alexa 488 laissent incubé quelque temps, ensuite ils perméabilisent les cellules pour faire entrer les anticorps couplés a un autre fluorophore (rouge celui la) et dirigé contre la clathrine. Et si les cellules sont en train d'endocyter le AAV via les puits de clathrine, ils devraient y avoir une colocalisation du marquage vert (AAV) et rouge (clathrine) au niveau sous membranaire voire membranaire.

En esperant t'avoir aider

Camu

[JPL]

C'est difficile de répondre sans avoir l'article sous les yeux.

Oui mais nous sommes tenus par les règles du droit.

[mzbercelin]

Merci Camus,
Je pense que l'infos qui me manquait c'est celui du deuxième anticorps couplé au fluorophore rouge. Dites moi, la visualisation se fait comment? est ce à l'aide d'un microscope à fluorescence ou Pas?
Merci d'avance.

[camulus]

En effet la visualisation se fait avec un microscope à fluorescence. Généralement il s'agit d'un microscope confocale. Tu peux trouver cette information dans le matériel et méthode de l'article. Je pense que dans le cadre de l’expérience que tu as décrite, le confocale est particulièrement adapté car il permet de générer des images de tranches de la cellule (comme si l'on rentre à l'intérieur de la cellule). Ce qui est très utile si on veut voir des phénomènes membranaires comme c'est le cas des endocytoses.

Content d'avoir pu t'aider, si tu as d'autres question n'hésite pas.

Camu

[Flyingbike]

Pour tout ce qui est mécanismes membrannaires, le TIRF est particulièrement adapté...

[mzbercelin]

Ah oui c'est vrai! ils ont fait de l'imagerie confocale (matériels et méthodes).
Merci encore.

[camulus]

Pour tout ce qui est mécanismes membrannaires, le TIRF est particulièrement adapté...

Entièrement d'accord le TIRF est la technique de choix pour tout ce qui est dynamique membranaire et c'est bien plus résolutif que le confocale (je disais confocale car je pense que dans le cadre de l'experience, cette technique est suffisante (pour la partie imagerie, biensure ils auront confirmer ou infirmer un quelconque résultat avec une autre technique))



Camu