PCR / sanger / amorces / séquences /

[Nyxolimbera]

Bonjour
J'ai un gros problème ..
Depuis deux heures je nages sur internet !
Je cherche à savoir comment on choisi les amorces pour un PCR ..
Dans l'exercices on me donne deux brins
5'-3'
3'-5'
Qui sont :
5'AGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCA ATGACTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGAT ATCCACTGA3'

3'TCAGTGTGGAGTCCATGGAAATTCTGGT TACTGATGTGTGGTCCCGGTCCCCAGTCTA TAGGTGACT5'

( j'ai mal aux yeux .. Lol )

Le premier " sens " deuxième anti-sense" ?

Moi je fais pour le premier
3'TCAGTGT5' ( je les appels 3-5 car j'ai fais la complémentarité.. Euhh je suis perdu deja )

deuxième
3'AGTCACC5'

Mais après je me pose 1 million de questions je cherche une logique et je me perds dans toutes mes questions ..

Svp de façon simple pourriez vous m'expliquer comment choisir les amorces ?
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[Loupsio]

Bonsoir
Ici tu ne peux pas choisir d'amorces pour ce fragments si tu était en situation réelle car tes amorces doivent etre bien plus espacées afin que la taille de l'amplicon soit d'environ 200 bases minimum (jusqu'a plusieurs milliers de bases genre 2 ou 3 mais pas beaucoup plus sinonca prendra trop de temps pour l'élongation)
or tu n'as ici pas 200 bases

Les primers doivent faire une 20aine de bases afin de s'assurer une bonne spécificité (entre 18 et 25 a peu près, c'est pas trop mal), et tu dois éviter certains profils, par exemple un GC % de 40 a 60 est pas mal, au dessus ou en dessous de ces proportions ca peut poser des problèmes,
la tempérture d'annealing (d'hybridation de ton amorce sur son complementaire au niveau du brin) doit se trouver entre 55 et 68 approximativement (le calcul simplifié de la température est quelque chose du genre : "le nombre de A + T multiplié par 2, + le nombre de C + G multiplié par 4, et ca te donne ta temperature pour le Ta qu'on appelle Tm), le nucleotide en dernière position est important aussi, il ne faut pas que ca soit n'importe lequel, et il est preferable de ne pas avoir plusieurs (genre 4 ou 5 ou plus) G a la suite vers la fin de ton primer sinon ca mène a des structure secondaire et ton primer ne sera pas linéaire et s'hybridera mal...

Tu peux trouver ces critères sur internet, mais je pense que ta séquence est bien trop courte pour pouvoir faire du design de primers

[Nyxolimbera]

Euuh jai oubliee !!!
Dans le premier 5-3
Au milieux il y a de l'espace qui indique sûrement que la chaîne est plus longue.
Il faut choisir des amies de 20 bases mais je sais pas si mon choix des amorces est bon ..
Car sur un forum
Une personne cherchait une amorce etait exactement les 20 premières base de 5-3.
Donc je suis complètement perdu.

[Nyxolimbera]

Et puis pourquoi dans mon cas c'est de 5´-3' la synthèse ( est ce qu'il y a d'autre cas meme lol )

[A voir en vidéo sur Futura]

[Nyxolimbera]

Rectification de mon deuxième message ..
Dans les deux au milieu il y a des points qui indique que les deux chaîne sont bcp plus longues.

[Loupsio]

Quels espaces? avec la mise en page ce n'est pas super visible, il aurai fallu représenter ces espaces, au moins par un 5'-AAAA[...]AAAA-3'

Et il y a un point ou je ne te comprend pas, tu à l'air au courant qu'il faille 20 bases (environ c'est pas un chiffre exact) pour les primers, et tu te demande si tes primers sont bon :

Il faut choisir des amies de 20 bases mais je sais pas si mon choix des amorces est bon ..

Tes amorces font 7 bases, évidemment que non ton choix n'est pas bon, je veux dire... si tu sais qu'il en faut 20 et que tu sais que les tiennes en font 7, comment peux tu te poser la question?, tu dois bien te rendres compte que 7 c'est différent de 20.

Et les amorces ne sont pas les "20 premieres" car sur ta feuille d'exercice il y a un debut et une fin a ta sequence mais en vrai on parle d'une sequence chromosomique donc le debut de ta sequence sur la feuille n'est pas un vrai debut, c'est juste qu'on va pas te mettre toutes les bases du chromosomes donc "debut" et "fin" non pas de sens ici donc "les 20 premieres exactement" ca ne représente rien, tu ne dois donc pas choisir les 20 premieres mais 20 qui correspondes au critères que je t'ai cité plus haut


PS : evite le double post si possible, utilise la fonction "Modifier la message" plutot que créer un autre message en dessous du précédent, surtout quand il n'y a qu'une minute d'écart ,

[Nyxolimbera]

Premièrement ..
C'est la première fois que j'écris sur ce forum alors je connais pas les bonne manières ..
Je suis sur mon td de PCR/ sanger depuis 6heures, jai li tellement de choses que je me suis complètement pardu. Alors en écrivant j'ai voulu aller un peu vite et au lieu de présenter 20 base j'en ai présenter que 7 seulement pour savoir si mon démarche etait bon.
Je vous remercie énormément pour le temps que vous consacrez à me répondre mais jai toujours pas compris, est ce que mon démarche pour les amorces est bonne ?
- pour le premier
Complémentarité de 5-3
- pour le deuxième
Complémentarité de la fin vers le début du brin
3-5 ?

[Loupsio]

Encore faudrais il le préciser, tu demandes si tu design bien tes amorces mais tu ne nous dis pas tout, évidemment meme si tu fais tout bien mais que tu n'en dis que la moitié alors on supposera que tu ne l'as fait qu'a moitié bien

Non, ils ne sont pas corrects tu as pris tes deux amorces au même endroit, ce qui signifie que tu n'amplifiera rien, il faut en prendre une a un endroit et l'autre a un autre endroit géographique de tes sequences, la tes deux amoces représente la partie gauche de tes séquences, il en faut une a gauche et une a droite

[Loupsio]

5'AGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCA ATGACTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGAT ATCCACTGA3'

3'TCAGTGTGGAGTCCATGGAAATTCTGGT TACTGATGTGTGGTCCCGGTCCCCAGTCTA TAGGTGACT5'

tu dois les placer d'un bout a l'autre

5'AGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCA[...] ATGACTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGAT ATCCACTGA3'

3'TCAGTGTGGAGTCCATGGAAATTCTGGT[...] TACTGATGTGTGGTCCCGGTCCCCAGTCTA TAGGTGACT5'

et la ta séquence amplifiée sera celle en bleu

[Nyxolimbera]

J'ai honte de vous dire ca mais " jai vraiment rien compris .. "
Car je vois aucune modification dans vos brins.
Dans mon cours on parle de complémentarité quand on choisi les amorces..
Et la reponse de mon exercice c'est
5- TCA GTG TGG AGT CCA TGG AA -3
5- AGT CAC ACC TCA GGT ACC TT-3
Je comprenais pas c'est pourquoi je fais des recherches et je comprends Tj pas

[Nyxolimbera]

Pourquoi je vois juste un changement de couleur ?

[Loupsio]

en rouge c'est la ou tu a choisi tes primers, en vert c'est les primers que tu dois choisir, en bleu c'est la sequence que tu vas amplifier

si ton primer correspond a ce qui est en vert, alors il va se fixer sur ce qui reste noir, et va amplifier la partie en bleu

[Nyxolimbera]

Je crois que j'ai compris ..
On va Tj de 5'-3' cest par 3' que la synthèse continu puisque l'extrémité 3´ du ose a la fonction alcool..
Pour un truc pareille je me suis cassée la tête croyez moi une journée entière ...
Merci bcp !
Une dernière question
Les température pour la dénaturation est Tj 94?
Pour l'hybridation 50
Pour l'élongation 72?
Où ça peut varié ( par exemple pour l'hybridation jai lu que ça pouvait varié .. Mais dans mon td on a noté 50!)

[Loupsio]

Oui la polymerase ne va prolonger que des extrémitées 3' dans le sens 5'->3'
La température de dénaturation cela dépend de la polymérase utilisée, plus tu chauffe plus tu es sur de bien dénaturer tes brins, pour la Taq polymérase on prend souvent 94° mais par exemple une phusion polymérase la dénaturation est de 98°C
La température d'hybridation est rarement de 50, tu dois choisir la température qui correspond a ta séquence (voir message #2) et pour l'élongation c'est souvent 72, mais la encore je crois que ca peut dépendre de la température optimale de l'activité de la polymérase